一种非核糖体多肽活性产物的获得方法技术
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种非核糖体多肽活性产物的获得方法，属于基因工程
技术介绍
非核糖体多肽是通过非核糖体途径合成的一系列低分子量、具有多种药用价值的多肽类次生代谢产物，在化学结构和生物活性上都具有丰富多样性。自然界中已经发现了一千多种非核糖体多肽化合物，包含多种抗生素、毒素、免疫抑制剂、生物表面活性剂、激素和抗肿瘤物质等。自然界中真菌能够合成许多种真菌毒素，像是白僵菌素、类白僵菌素、恩镰孢菌素等，这些天然物质大都具有广泛的生物学活性，如抗菌、杀虫、除草、抗逆转录以及化学增敏等活性，还有一些被证明能够抑制阿兹海默症中老年斑的形成以及抑制新生肿瘤形成等。这些真菌毒素就是非核糖体多肽中重要的一大类。但是从自然界中获得可合成以上物质的野生菌非常困难且产量少。所以目前获取工艺几乎为通过化工获取，化工方式的缺陷为产量低，工艺复杂，生物方式合成产量高，且可控，但菌株获得困难。以生物的方式指导合成非核糖体多肽需要经由一类称为非核糖体多肽合成酶来完成，它是一类大的多酶复合物，由一系列被称为模块的重复催化单位和结构单位所组成，具有广泛的催化底物特异性，适合于新型化合物分子的工程化生物合成。充分了解这些酶的催化机制有利于通过人工途径获得非核糖体多肽，也是合成新型化合物的关键。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种非核糖体多肽活性产物的获得方法，通过合理设计并重新构建基因工程菌，更有效地生产非核糖体多肽。实现本专利技术的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种非核糖体多肽活性产物的获得方法，其包括：以纯化的BeauveriabassianaATCC...
【技术保护点】
一种非核糖体多肽活性产物的获得方法，其特征在于，其包括：以纯化的Beauveria bassiana ATCC 7159菌株DNA为模板，通过聚合酶链式反应分别扩增出具有AscI位点的目标基因片段G1和具有B srGI位点的目标基因片段G2，然后将G1连接到载体的NheI和PmlI位点之间，构建质粒P1，G2连接到另一个载体的NdeI和PmlI位点之间，构建质粒P2的步骤；和，以P1和P2为模板，通过重叠延伸PCR技术，扩增出目标基因片段G3的步骤；和，将G3连接到P1的AscI和PmlI位点之间或P2的BsrGI和PmlI位点之间，获得重组质粒P3的步骤；和，将P1、P2或P3与包含NpgA基因片段的质粒P4共转化导入标准菌株ATCC 208288，得到基因工程菌的步骤；和将基因工程菌进行培养发酵，提取，得到非核糖体多肽活性产物的步骤。
【技术特征摘要】
1.一种非核糖体多肽活性产物的获得方法，其特征在于，其包括：以纯化的BeauveriabassianaATCC7159菌株DNA为模板，通过聚合酶链式反应分别扩增出具有AscI位点的目标基因片段G1和具有BsrGI位点的目标基因片段G2，然后将G1连接到载体的NheI和PmlI位点之间，构建质粒P1，G2连接到另一个载体的NdeI和PmlI位点之间，构建质粒P2的步骤；和，以P1和P2为模板，通过重叠延伸PCR技术，扩增出目标基因片段G3的步骤；和，将G3连接到P1的AscI和PmlI位点之间或P2的BsrGI和PmlI位点之间，获得重组质粒P3的步骤；和，将P1、P2或P3与包含NpgA基因片段的质粒P4共转化导入标准菌株ATCC208288，得到基因工程菌的步骤；和将基因工程菌进行培养发酵，提取，得到非核糖体多肽活性产物的步骤。2.如权利要求1所述的非核糖体多肽活性产物的获得方法，其特征在于包括以下步骤：1)构建重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3(bbBeas)inpESC-URA：①以纯化的BeauveriabassianaATCC7159菌株DNA为模板，使用引物组合：上游引物bbBeas-F:5’-aaGCTAGCatggagccgctcaaaaatgt-3’，下游引物bbBeas-R:5’-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3’，通过聚合酶链式反应扩增目标基因片段C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3(bbBeas)，扩增反应的条件为：95℃40秒，63℃40秒，72℃15.5分钟，36个循环；②利用限制性核酸内切酶NheI和PmlI将步骤①扩增得到的目标基因片段连接到pESC-URA载体上的NheI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3(bbBeas)inpESC-URA；2)构建重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3(bbBsls)inpESC-URA：Ⅰ)以纯化的BeauveriabassianaATCC7159菌株DNA为模板，使用引物组合：上游引物bbBsls-F:5′-aaCATATGgagccacccaacaacgc-3′，下游引物bbBsls-R:5′-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3′，通过聚合酶链式反应扩增目标基因片段C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3(bbBsls)，扩增反应的条件为：95℃40秒，63℃40秒，72℃15.5分钟，36个循环；Ⅱ)利用限制性核酸内切酶NdeI和PmlI将上述扩增得到的基因片段连接到pESC-URA载体上的NdeI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3(bbBsls)inpESC-URA；3)通过以下A、B、C、D、E或F步骤构建重组质粒；AA1.以步骤1)得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3(bbBeas)inpESC-URA和步骤2)得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3(bbBsls)inpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，上游片段下游引物BbBEASwithT2aT2bC3(BbBSLS)-R:5'-ggtgccgacttttgcaccatcgtcgtcgtccggg-3'，下游片段上游引物BbBEASwithT2aT2bC3(BbBSLS)-F:5'-cccggacgacgacgatggtgcaaaagtcggcacc-3'，下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；得到目标基因片段(AscI)bbBeaswithT2aT2bC3(bbBsls)；A2.利用限制性核酸内切酶AscI和PmlI将步骤A1中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3(bbBeas)inpESC-URA的AscI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MT(bbBeas)T2aT2bC3(bbBsls)inpESC-URA；BB1.以步骤1)得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3(bbBeas)inpESC-URA和步骤2)得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3(bbBsls)inpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，上游片段下游引物BbBEASwithT2bC3(BbBSLS)-R:5'-tctttcttgtcctggcctccaccaccattcaaag-3'，下游片段上游引物BbBEASwithT2bC3(BbBSLS)-F:5'-ctttgaatggtggtggaggccaggacaagaaaga-3'，下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；得到目标基因片段(AscI)bbBeaswithT2bC3(bbBsls)；B2.利用限制性核酸内切酶AscI和PmlI将步骤B1中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3(bbBeas)inpESC-URA的AscI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2a(bbBeas)T2bC3(bbBsls)inpESC-URA；CC1.以步骤1)得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3(bbBeas)inpESC-URA和步骤2)得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3(bbBsls)inpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，上游片段下游引物BbBEASwithC3(BbBSLS)-R:5'-gcatcggcggcgggaatgagttgaaacgcagtgt-3'，下游片段上游引物BbBEASwithC3(BbBSLS)-F:5'-acactgcgtttcaactcattcccgccgccgatgc-3'，下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；得到目标基因片段(AscI)bbBeaswithC3(bbBsls)；C2.利用限制性核酸内切酶AscI和PmlI将步骤C1中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2a...
【专利技术属性】
技术研发人员：占纪勋，于大禹，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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