包含F1、F3多肽的药物组合物及其在治疗HPV感染疾病中的应用制造技术

本发明专利技术涉及多肽药物制剂技术领域，具体是包含F1、F3多肽的药物组合物及其在治疗HPV感染疾病中的应用。每份药物组合物中含F1、F3多肽或者二者的混合物为3~30μg，该组合物制备成乳剂、软膏制剂等多种常规剂型，用于治疗HPV感染引起的尖锐湿疣、宫颈癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌和口腔癌等易复发的疾病。本发明专利技术具有使用疗程短，有效成分用量较少、疗效确切、复发率低、副作用小，治疗费用低等优势，给患者带来非常好的治疗途径。

Pharmaceutical compositions comprising F1 and F3 polypeptides and their use in the treatment of HPV infection diseases

The invention relates to the technical field of polypeptide drug preparations, in particular to a pharmaceutical composition containing F1 and F3 polypeptides and the use thereof in the treatment of HPV infection diseases. The mixture containing F1, each in the pharmaceutical compositions of F3 polypeptide or two for 3~30 g, the composition is prepared into emulsion, ointment and other forms, for the treatment of HPV infection caused by condyloma and cervical cancer, vulvar cancer, penile cancer, anal cancer and oral cancer, easy relapse of disease. The invention has the advantages of short use period, less effective component dosage, accurate curative effect, low recurrence rate, small side effect, low treatment cost, etc., and brings a very good treatment way for the patient.

【技术实现步骤摘要】
包含F1、F3多肽的药物组合物及其在治疗HPV感染疾病中的应用
本专利技术涉及多肽药物制剂
，具体是包含F1、F3多肽的药物组合物及其在治疗HPV感染疾病中的应用。
技术介绍
慢性人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV）感染可以引起多种疾病。宫颈癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌和口腔癌均可由感染HPV引起。宫颈癌是常见恶性肿瘤之一，发病率占女性肿瘤第二位，其发生与HPV、特别是16、18型HPV的持续感染密切相关。尽管用于预防HPV感染的疫苗已于2006年开始应用，但此类疫苗仅适用于从未感染的健康个体，对现症HPV感染及其所致疾病无效。目前全球每年仍有约50万新发宫颈癌病例，约20万妇女死于该病。我国已有宫颈癌患者40万人，死亡率达11.3%。外阴癌、阴茎癌、肛门癌和口腔癌亦是临床常见恶性肿瘤。此外，HPV感染还可以导致呼吸道，生殖器官的病变，尖锐湿疣和复发性呼吸道乳头瘤病，前者是一种常见的性传播疾病；后者是少见病，多见于婴幼儿，有时会危及生命，这两种疾病常因感染HPV6，11型引起。尖锐湿疣是一种性传播疾病，主要通过不洁性交传播。约有1%的性活跃者患有尖锐湿疣，是最常见的性传播疾病之一。临床表现为生殖器，肛门部位疣状新生物，部分患者持续感染或治疗后反复发作。人体对HPV的细胞免疫是控制尖锐湿疣重要免疫机制。免疫缺陷患者尖锐湿疣常常多发，顽固，不易治疗。尖锐湿疣患者众多，严重侵占医疗资源，且影响社会稳定。目前尚无可以根治尖锐湿疣的方法。通常采用物理或者化学方法去除疣体，如冷冻，激光切除等，此类疗法不易完全去除湿疣体，患者极易复发。免疫疗法治疗尖锐湿疣，如干扰素α湿疣体局部注射，非特异性的免疫治疗也部分有效。5%Imiquimod（5%咪喹莫特）乳剂局部涂抹是目前国际通行的治疗尖锐湿疣的最有效方法，有效率50%-70%，复发率在10%左右。多肽F1，F3序列首次发表于文献S.T.Steinborner,etal.,J.Pept.Res.,1998,51,121,见第4页,其中F1序列为:GLLSVLGSVAKHVLPHVVPVIAEHL-NH2；F3序列为:GLFGVLGSIAKHLLPHVVPVIAEKL-NH2。文献M.A.Apponyi,etal.,Peptides,2004,25,1035中还公开了F1有体外抑制肿瘤作用；F3对肿瘤的作用未见报道，而且目前尚未有F1，F3治疗尖锐湿疣以及二者叠加效应的相关报道。因此，目前急需开发一种疗程短，有效成分用量较少、疗效确切、复发率低、副作用小，治疗费用低的药物。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服现有治疗方法无法根治HPV感染的相关疣如尖锐湿疣或实体肿瘤的疾病，疗效低、复发率高、副作用多、疗程长、费用高等缺陷，提供一种包含F1、F3多肽的药物组合物，用于治疗HPV感染的相关疣或实体肿瘤的疾病。为解决上述问题，本专利技术通过以下技术方案得以解决：首先提供一种F1或F3多肽的制备方法，包括如下步骤：1)首先通过9伏特的直流电刺激的方式促使树蛙分泌出外观呈白色的粘稠状液体。2）将液体收集并转移至含有15%~30%醇的水溶液中，优选20%甲醇或乙醇水溶液，震荡再通过0.45μm的PVDF膜过滤。3）滤出清液在真空低温离心干燥剂中干燥，形成白色固体粉末。4）将白色固体粉末溶解于0.1%的三氟乙酸中，通过高通量高效液相色谱和质谱联用分析其中的多肽序列及具有的翻译后修饰。5）利用固相多肽合成方法分别合成多肽F1或F3，具体步骤如下：a)在CS336X的多肽合成仪上，以氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，将F1或F3的C端氨基酸（氨基被封闭基团）保护的氨基酸共价连接在固相载体上；b）在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了；c)然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过N,Nˊ-二环己基碳二亚胺（DCC，Dicyclohexylcarbodiimide）活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽；d)重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后脱去保护基，在TFA/DCM/H20/TIPS的体积比为90：5：2.5：2.5的溶液中自发进行树脂的去保护和解聚；d)通过10倍当量的冷乙醚对其沉淀，并用反相高效液相色谱纯化后获得多肽F1或F3。特别地，在合成过程中，谷氨酸和丝氨酸侧链羧基用t-Bu保护，而为防止组氨酸的消旋化，其侧链用Boc基团保护。其中TFA为三氟乙酸的英文缩写。该方法制备的多肽纯度高，而且制备方法简单易操作，成本低。本专利技术提供了第一种药物组合物，包含F1、F3多肽中任意一种或二者任意比例的混合物和药学上可接受的辅料。作为优选，所述的药物组合物制备成适合胃肠外给药的静脉注射、肌内注射或皮下注射的注射液；或经皮肤穿透给药的乳剂或软膏制剂，更优选乳剂或软膏制剂。进一步的，每份药物组合物中含F1、F3多肽或者二者的混合物为3~30μg，优选5~20μg。本专利技术还提供了第二种药物组合物，进一步包含Imiquimod，所述的药物组合物制备成适合胃肠外给药的静脉注射、肌内注射或皮下注射的注射液；或经皮肤穿透给药的乳剂或软膏制剂，优选乳剂或软膏制剂。第二种药物组合物的机理是通过F1，F3组合诱导HPV感染细胞的凋亡，释放更多的病毒抗原供抗原提呈细胞摄取，然后通过Imiquimod的非特异性的免疫刺激作用，诱导更强的特异性免疫反应，从而达到Imiquimod，或者F1和F3单独使用不可能达到的疗效。其中Imiquimod是一种非特异性的免疫调节剂，通过刺激Toll样受体7/8激活非特异性免疫反应，进而激活特异性的T细胞反应来杀死病毒感染细胞，并且直接诱导HPV6，11感染细胞凋亡而达到治疗效果。本专利技术提供的第一种药物组合物在制备预防和/或治疗HPV感染导致的疾病的药物中的用途，所述疾病为疣或实体肿瘤，所述的疣优选尖锐湿疣；所述的实体肿瘤包括并不限于宫颈癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌和口腔癌。本专利技术提供的第二种药物组合物在制备预防和/或治疗HPV感染导致的疾病的药物中的用途，所述疾病为疣或实体肿瘤，所述的疣优选尖锐湿疣；所述的实体肿瘤包括并不限于宫颈癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌和口腔癌。本专利技术提供的第二种药物组合物联合放射性治疗、化学治疗、治疗性疫苗中任意一种或多种在制备预防和/或治疗HPV感染导致的疾病的药物中的用途，所述疾病为实体肿瘤，所述的实体肿瘤包括并不限于宫颈癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌和口腔癌。为了从机理上探讨其抑制作用，高通量定量蛋白组分析被用于对于分析多肽作用前后的细胞内和上清中蛋白组的变化情况。用胰蛋白酶将分离出的蛋白进行了水解，并用iTRAQ对水解产生的多肽进行了标记，进而应用纳米高效液相色谱及三重时间飞行质谱联用系统对标记多肽进行了定量分析。结果显示，若干与细胞免疫相关的关键信号通路被激活或抑制。以图4为例，与未处理相比较，F1、F3明显激活了TEC激酶信号通路，而导致的结果之一即是肿瘤细胞的凋亡；此外，将F3，对照多肽P3标记荧光FITC，与TC-1共同培养不同时间，反复洗涤后本文档来自技高网...

【技术保护点】
F1或F3多肽的制备方法，包括如下步骤：1)首先通过9伏特的直流电刺激的方式促使树蛙分泌出外观呈白色的粘稠状液体；2）将液体收集并转移至含有15%~30%醇的水溶液中，优选20%甲醇或乙醇水溶液，震荡再通过0.45μm的PVDF膜过滤；3）滤出清液在真空低温离心干燥剂中干燥，形成白色固体粉末；4）将白色固体粉末溶解于0.1%的三氟乙酸中，通过高通量高效液相色谱和质谱联用分析其中的多肽序列及具有的翻译后修饰；5）利用固相多肽合成方法分别合成多肽F1或F3，具体步骤如下：a)在CS336X的多肽合成仪上，以氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，将F1或F3的C端氨基酸（氨基被封闭基团）保护的氨基酸共价连接在固相载体上；b）在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了；c) 然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过N,Nˊ‑二环己基碳二亚胺（DCC，Dicyclohexylcarbodiimide）活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽；d) 重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度；最后脱去保护基，在TFA/DCM/H...

【技术特征摘要】
1.F1或F3多肽的制备方法，包括如下步骤：1)首先通过9伏特的直流电刺激的方式促使树蛙分泌出外观呈白色的粘稠状液体；2）将液体收集并转移至含有15%~30%醇的水溶液中，优选20%甲醇或乙醇水溶液，震荡再通过0.45μm的PVDF膜过滤；3）滤出清液在真空低温离心干燥剂中干燥，形成白色固体粉末；4）将白色固体粉末溶解于0.1%的三氟乙酸中，通过高通量高效液相色谱和质谱联用分析其中的多肽序列及具有的翻译后修饰；5）利用固相多肽合成方法分别合成多肽F1或F3，具体步骤如下：a)在CS336X的多肽合成仪上，以氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，将F1或F3的C端氨基酸（氨基被封闭基团）保护的氨基酸共价连接在固相载体上；b）在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了；c)然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过N,Nˊ-二环己基碳二亚胺（DCC，Dicyclohexylcarbodiimide）活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽；d)重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度；最后脱去保护基，在TFA/DCM/H20/TIPS的体积比为90：5：2.5：2.5的溶液中自发进行树脂的去保护和解聚；d)通过10倍当量的冷乙醚对其沉淀，并用反相高效液相色谱纯化后获得多肽F1或F3；特别地，在合成过程中，谷氨酸和丝氨酸侧...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓松，倪国颖，王天放，
申请(专利权)人：王天放，倪国颖，刘晓松，
类型：发明
国别省市：安徽,34