一种微量多肽化学衍生体系及衍生方法技术

本发明专利技术提供了一种微量多肽化学衍生体系，该体系由置于Eppendorf枪头中的、由上至下的三层填料层组成；其中，最上层的填料为反相硅胶，中间层的填料为磺酸基阳离子交换键合硅胶，最下层的填料为反相硅胶。本发明专利技术还提供了所述微量多肽化学衍生体系的制备方法，以及应用所述微量多肽化学衍生体系进行多肽正电荷衍生的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多肽分析领域，具体涉及一种微量多肽化学衍生体系及该体系的制备方法，还涉及利用该微量多肽化学衍生体系进行多肽正电荷衍生的方法。
技术介绍
在质谱(Mass Spectrometry, MS)技术中，串联质谱(MS/MS)可用于获得目标物质结构的碎片，从而对目标物质进行结构分析。目前，通过液相色谱-串联质谱联用系统(LC-MS/MS)可以很容易地分离与裂解复杂的多肽混合物，从而进行蛋白质的结构分析。数据库检索法是使用串联质谱进行蛋白质结构分析时的常规方法。该方法是从特定的蛋白质数据库中提取目标物质所有的肽段序列，并将它们与串联质谱所得谱图进行比较和打分，找到可能性最大的肽段序列。但是，对于基因组未测序的物质，由于无法建立相应的蛋白质数据库，常规的数据库检索方法无法获得可以与质谱谱图进行比较分析的多肽序列。多肽从头测序技术通过串联质谱谱图上碎片离子之间的质量差得到对应的氨基酸残基，可得到所有物种的肽段序列及翻译后修饰，无需借助蛋白质数据库进行检索和比较即可对多肽序列进行鉴定。多肽从头测序有着很大的发展潜力，但是目前低可信度的鉴定结果限制了该技术的广泛应用。这种低可信度主要是由不充分的裂解以及同时产生的N-端系列离子和C-端系列离子相互重叠导致的。目前，为了避免N-端与C-端系列离子的重叠，提高多肽从头测序的可信度，可采用多肽N-末端衍生技术进行图谱简化处理。该技术包括多肽N-末端的负电荷衍生与正电荷衍生。其中，多肽N-末端正电荷衍生是指在多肽N-末端引入一个季铵基团或季膦基团，从而提高二级谱图中多肽N-末端碎片离子的信号强度。(琥珀酰亚胺氧基擬基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化憐(Succinimidyloxycarbonylmethyltris(2, 4, 6-trimethoxyphenyl)phosphonium bromide, TMPP-Ac-OSu)是一种重要的多妝N-端正电荷衍生试剂，它可在一个简单、快速、温和的条件下对多肽的N-端进行特异性的衍生。传统的TMPP-Ac-OSu衍生方法为溶液方法，其缺点是衍生反应产生大量以TMPP-Ac-OH为主的副产物，严重影响微量样品(〈lpmol)或者复杂样品中低丰度多肽的序列分析。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种微量多肽化学衍生体系，并提供该体系的制备方法。本专利技术的另一目的是提供利用所述微量多肽化学衍生体系进行正电荷衍生的方法，该方法可有效去除衍生反应副产物，减少多肽衍生物的损失，提高衍生多肽的质谱分析灵敏度。本专利技术提供了一种微量多肽化学衍生体系，该体系由置于Eppendorf枪头中的、由上至下的三层填料层组成，分别为最上层、中间层和最下层。具体地，最上层为衍生反应层；其作用为为衍生反应中的肽段与衍生试剂提供固相结合介质。最上层的厚度为3?5mm。最上层的填料为反相硅胶填料，填料粒径为3?10 μ m。所述反相硅胶选用C8或C18,优选为C8。中间层为副产物去除层；其作用为去除衍生反应中的盐离子和反应副产物等杂质；作用原理为阳离子交换原理，即:衍生肽段与填料结合，副产物被洗脱。中间层的厚度为3?5mm。中间层的填料为磺酸基阳离子交换键合硅胶SCX填料，填料粒径为3?10 μ m。最下层为脱盐洗脱层；其作用为将衍生反应中的各种盐去除得到纯化的衍生多肽；作用原理为反相色谱洗脱原理，即:衍生肽段与填料结合，盐被洗脱。最下层的厚度为3?5mm。最下层的填料为反相硅胶填料，填料粒径为3?10 μ m。所述反相硅胶选用C8或C18，优选为C8。所述Eppendorf枪头为实验室常用Eppendorf枪头,规格为200 μ I。本专利技术还提供了所述微量多肽化学衍生体系的制备方法。所述方法包括以下步骤:I)将一片直径为I?2mm的特氟龙薄膜水平放置到Eppendorf枪头底部，以防止填料漏出；2)将反相硅胶的甲醇悬浊液缓慢加入特氟龙薄膜之上，进行离心，离心机转速为1000 Xg,离心时间为5min,最下层即得；3)将SCX的甲醇悬浊液缓慢加入步骤2)所得最下层之上，进行离心，离心机转速为1000 Xg,离心时间为5min,中间层即得；4)将反相硅胶的甲醇悬浊液缓慢加入步骤3)所得中间层之上，进行离心，离心机转速为lOOOXg，离心时间为5min，微量多肽化学衍生体系即得。本专利技术还提供了利用所述微量多肽化学衍生体系进行多肽正电荷衍生的方法。所述方法包括以下步骤:衍生体系的平衡；样品与正电荷衍生试剂的载入；正电荷衍生反应；副产物的洗脱；衍生多肽的脱盐；衍生多肽的洗脱。具体地，所述正电荷衍生试剂选用TMPP-Ac-OSu ；所述副产物包括TMPP-Ac-OH ；所述方法包括以下具体步骤:I)衍生体系的平衡:使用45%乙腈100 μ L进行系统的清洗，使用0.1 %三氟乙酸溶液100 μ L进行系统的平衡；2)样品的载入:将多肽样品与TMPP-Ac-OSu衍生试剂以质量比1:2溶解于含5%乙腈与0.1 %三氟乙酸的溶液100 μ L，载入微量反应体系最上层；3)衍生反应:载入ρΗ8.2、浓度为20mmol/L的碳酸氢钠缓冲液100 μ L，引发衍生反应；室温下孵育2小时后，使用0.1 %三氟乙酸溶液100 μ L进行清洗，终止衍生反应；4)副产物的去除:使用ΡΗ3.0、含有5mmol/L磷酸二氢钾和45%乙腈的缓冲液AlOO μ L进行洗脱，将衍生多肽产物从最上层洗脱下来并结合到中间层，同时将以TMPP-Ac-OH为主的衍生反应副产物除去；使用ρΗ3.0、含有5mmol/L磷酸二氢钾、500mmol/L氯化钾和45 %乙腈的缓冲液BlOO μ L进行洗脱，将衍生多肽产物从中间层洗脱下来并结合到最下层；5)衍生多肽的脱盐:使用0.1 %三氟乙酸溶液100 μ L进行洗脱，去除衍生反应中的盐杂质；6)衍生多肽的洗脱:使用45%乙腈100μ L进行洗脱，衍生多肽样品即得。本专利技术还提供了所述微量多肽化学衍生体系在多肽从头测序中的应用。所述应用为将由所述衍生体系及相应衍生方法得到的衍生多肽用于质谱分析。本专利技术具有以下显著技术效果:1、传统的正电荷衍生反应在溶液中进行，衍生多肽与大量副产物和杂质混合在一起，影响反应效率和后续的质谱分析；本专利技术提供的微量多肽化学衍生体系结构简单、操作简便，能有效去除副产物和杂质，显著提高了多肽正电荷衍生反应的效率和衍生多肽的质谱分析灵敏度；2、本专利技术提供的微量多肽化学衍生体系将多肽的衍生与副产物的去除和脱盐有效整合在一个体系内进行，可有效降低由于样品多次转移导致的样品损失。【附图说明】图1为本专利技术所述微量多肽化学衍生体系结构图；其中，I为Eppendorf枪头；2为最上层C8或C18填料层；3为中间层SCX填料层；4为最下层C8或C18填料层。图2为利用C8-SCX-C8衍生体系进行多妝正电荷衍生反应流程图。图3为大鼠C6细胞的正电荷衍生多肽的总离子流图，其中，(A)为传统溶液衍生方法所得衍生多肽使用C18色谱柱分离所得总离子流图，(B)为本专利技术所述方法所得衍生多肽使用C18色谱柱分离所得总离子流图，(C)为本专利技术所述方法所得衍生多肽使用C8色谱柱分离所得总离子流图。【具体实施方式】实施例1:C8-SCX_C8S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微量多肽化学衍生体系，该体系由置于Eppendorf枪头中的、由上至下的三层填料层组成；其中，最上层的填料为反相硅胶，中间层的填料为磺酸基阳离子交换键合硅胶，最下层的填料为反相硅胶。

【技术特征摘要】
1.一种微量多肽化学衍生体系，该体系由置于Eppendorf枪头中的、由上至下的三层填料层组成；其中，最上层的填料为反相硅胶，中间层的填料为磺酸基阳离子交换键合硅胶，最下层的填料为反相硅胶。2.根据权利要求1所述的化学衍生体系，其特征在于，各填料层的厚度为3?5mm。3.根据权利要求1所述的化学衍生体系，其特征在于，各填料的粒径为3?10μ m。4.根据权利要求1所述的化学衍生体系，其特征在于，所述反相硅胶选用C8或C18，优选为c8。5.根据权利要求1所述的化学衍生体系，其特征在于，所述Eppendorf枪头为实验室常用Eppendorf枪头，规格为200 μ I。6.权利要求1所述微量多肽化学衍生体系的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 1)将一片直径为I?2mm的特氟龙薄膜水平放置到Eppendorf枪头底部； 2)将反相硅胶悬浊液缓慢加入特氟龙薄膜之上，进行离心，最下层即得； 3)将磺酸基阳离子交换键合硅胶悬浊液缓慢加入步骤2)所得最下层之上，进行离心，中间层即得； 4)将反相硅胶悬浊液缓慢加入步骤3)所得中间层之上，进行离心，微量多肽化学衍生体系即得； 其中，各离心步骤的离心机转速为1000 X g，离心时间为5min。7.一种应用权利要求1所述微量多肽化学衍生体系进行多肽正电荷衍生的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: I)衍生体系的平衡；2)样品与正电荷衍生试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪建国，王青松，安明瑞，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11