本发明专利技术涉及用于生成神经毒素敏感的、神经元分化的细胞的方法，所述方法包括步骤为：a)在引发所述肿瘤细胞神经元分化的条件和时间下，在培养基中培养能够分化为神经元细胞的肿瘤细胞；和b)在具有100至270mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度，并且包含(i)B27补充物和/或(ii)N2补充物的分化培养基中培养a)的经引发神经元分化的肿瘤细胞至少3天，从而获得神经毒素敏感的、神经元分化的细胞。本发明专利技术还涉及通过本发明专利技术的方法可获得的神经毒素敏感的、神经元分化的细胞。此外，本发明专利技术涵盖用于测定神经毒素多肽的活性的方法，所述方法包括步骤为：a)将通过本发明专利技术的方法可获得的神经毒素敏感的、神经元分化的细胞与神经毒素多肽相接触；b)在允许神经毒素多肽发挥其生物学活性的条件下培养步骤a)的神经毒素敏感的、神经元分化的细胞3至74小时或72小时；和c)在根据步骤b)培养后，测定所述细胞中神经毒素多肽的活性。最后，本发明专利技术提供包含OptiMEM、FBS、B27补充物、和N2补充物的培养基。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】用于测定神经毒素多肽的生物学活性的细胞测试系统 本专利技术涉及用于生成神经毒素敏感的、神经元分化的细胞的方法，所述方法包括 步骤为：a)在引发所述肿瘤细胞神经元分化的条件和时间下，在培养基中培养能够分化为 神经元细胞的肿瘤细胞；和b)在具有100至270m0sm/kg的重量摩尔渗透压浓度，并且包 含（i)B27补充物和/或（ii)N2补充物的分化培养基中培养a)的经引发神经元分化的肿 瘤细胞至少3天，从而获得神经毒素敏感的、神经元分化的细胞。本专利技术还涉及通过本发 明的方法可获得的神经毒素敏感的、神经元分化的细胞。此外，本专利技术涵盖用于测定神经 毒素多肽的活性的方法，所述方法包括步骤为：a)将通过本专利技术的方法可获得的神经毒素 敏感的、神经元分化的细胞与神经毒素多肽相接触；b)在允许神经毒素多肽发挥其生物学 活性的条件下培养步骤a)的神经毒素敏感的、神经元分化的细胞3至74小时或72小时； 和c)在根据步骤b)培养后，测定所述细胞中神经毒素多肽的活性。最后，本专利技术提供包含 OptiMEM、FBS、B27补充物、和N2补充物的培养基。 肉毒梭菌（Clostridium botulinum)和破伤风梭菌（Clostridium tetani)生产 强力的神经毒素，即分别是肉毒梭菌毒素（BoNT)和破伤风毒素（TeNT)。这些梭菌神经毒 素（CNT)特异性结合神经元细胞并且破坏神经递质释放。每种毒素都作为无活性的未加工 的约150kDa的单链蛋白质合成。翻译后加工涉及二硫桥的形成，和细菌蛋白酶的有限的 蛋白水解作用（切割）。活性神经毒素由两条链组成，约50kDa的N端轻链和约IOOkDa的 重链，两链通过二硫键连接。CNT结构上和功能上由3个结构域组成，即，催化轻链、涵盖了 易位结构域（N端一半）和受体结合结构域（C端一半）的重链；参见，例如，Krieglstein 1990,Eur J Biochem 188, 39 ；Krieglstein 1991,Eur J Biochem 202,41 ；Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49。肉毒梭菌神经毒素是作为分子复合物合成的，所述复合物包 含150kDa神经毒素蛋白和相关联的无毒蛋白。复合物大小基于梭菌菌株和范围从300kDa， 至500kDa以上，和900kDa的不同神经毒素血清型而不同。这些复合物中的无毒蛋白使神 经毒素稳定，并保护其免受降解；参见Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19-S26。 肉毒梭菌分泌命名为肉毒梭菌神经毒素（BoNT)的A至G的7种抗原性不同的 血清型。所有的血清型与由破伤风梭菌分泌的相关破伤风神经毒素（TeNT)都是Zn 2+-内 切蛋白酶，其通过切割SNARE蛋白阻断突触的胞外分泌；参见Couesnon，2006, Mi crob i ology，152, 759。CNT导致在肉毒中毒和破伤风中所见的弛缓性肌肉麻痹；参见Fischer 2007, PNAS 104,10447。 不论其毒性效应，肉毒梭菌毒素复合物已在多种疾病中被用作治疗剂。肉毒梭菌 毒素 A血清型于1989年在美国被批准用于人用途，用于治疗斜视、睑痉挛和其他病症。它 作为肉毒梭菌毒素 A(BoNT/A)蛋白制备物是可商购的，例如商标名BOTOX (Allergan Inc) 或商标名DYSP0RT/REL0XIN(IpSen Ltd)。改良的、不含复合物的肉毒梭菌毒素 A制备物是 可商购的，商标名为XE0MIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)。出于治疗应用，将制备物直接 注射入待治疗的肌肉中。在生理PH下，毒素从蛋白质复合物中释放并且产生所需的药理学 作用。肉毒梭菌毒素的效应只是暂时的，这是为何维持治疗效果需要重复施用肉毒梭菌毒 素的原因。 梭菌神经毒素弱化主动肌肉强度并且是斜视、局限性肌张力障碍（包括颈肌张力 障碍和良性自发性睑痉挛）的有效疗法。其还表现出缓解偏侧面肌痉挛和局部痉挛，并且 对广泛的其他适应证有效，例如胃肠道病症、多汗症和美容皱纹校正；见Jost 2007, Drugs 67, 669。 在生产梭菌神经毒素的过程中，所述神经毒素的定性和定量测定以及生物学活性 的神经毒素多肽的质量控制是特别重要的。此外，政府机构仅接受简单、可靠和经验证的肉 毒梭菌毒素活性测定法。目前，小鼠 LD5tl生物测定法，一种致死性测试，依然是药物生产商 用于分析其制备物的效能的"金标准";见Arnon等人（2001) ,JAMA 285,1059-1070。然而， 在近些年，已经进行了相当多的努力以寻找备选的方法以减轻对动物测试的需要和与此类 型的基于动物的测定法相关的全部缺点、成本和伦理学顾虑。此外，管理机构要求制药公司 对肉毒梭菌神经毒素的效能测试应用3 "R"原则："降低（Reduce)，精炼（Refine)，替代 (Replace) ";见 Straughan, Altern. Lab. Anim. (2006)，34, 305-313。因此，已经开发了基于 细胞的测试系统以提供使用活动物的方法的合理的备选方法。然而，迄今仅有3个已显示 对神经毒素多肽足够敏感的细胞测试系统对于测定神经毒素生物学活性是可用的。这些基 于细胞的测试系统包括使用从啮齿类动物胚胎分离的在体外分化的原代神经元（Pellett 等人（2011)，Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388-392)，神经元分化的诱导的多能干 细胞（Whitemarsh 等人（2012) ,Toxicol. Sci. 126, 426-35)，和 SiMa 细胞系的亚克隆（W0 2010/105234A1)。 然而，分离原代神经元需要杀死动物并且是费力费时的。此外，使用不同原代神经 元的测试系统显示了大的变异性。类似地，生成神经元分化的诱导的多能干细胞是困难的 并且费时的。此外，此类细胞的贮藏是非常麻烦的。使用肿瘤细胞系的测定法通常对BoNT 不够敏感。并且，所述肿瘤细胞系需要复杂的分化方案，这导致使用所述细胞系的测定法的 大的变异性和/或高失败率。 有鉴于上述，可被政府机构接受并且提供基于动物的测试系统的备选方法的用于 测定神经毒素多肽活性的其他测试系统是高度渴求的。 因此，本专利技术的技术问题可以看作为提供符合前述需求的工具和方法。此技术问 题由在权利要求书和下文中所表征的实施方式解决。 在第一个方面，本专利技术涉及生成神经毒素敏感的、神经元分化的细胞的方法，所述 方法包括步骤为： a)在引发所述肿瘤细胞神经元分化的条件和时间下，在培养基中培养能够分化为 神经元细胞的肿瘤细胞；和 b)在具有100至270m0sm/kg的重量摩尔渗透压浓度，并且包含（i)B27补充物和 /或（ii) N2补充物的分化培养基中培养a)的经引发神经元分化的肿瘤细胞至少3天，从而 获得神经毒素敏感的、神经元分化的细胞。 在本专利技术的方法中，在引发所述肿瘤细胞神经元分化的条件和时间下，首先在细 胞培养基中生长能够分化成神经元细胞的肿瘤细胞。之后，将如此经引发神经元分化的肿 瘤细胞转移至具本文档来自技高网...
【技术保护点】
生成神经毒素敏感的、神经元分化的细胞的方法，所述方法包括步骤为：a)在引发所述肿瘤细胞神经元分化的条件和时间下，在培养基中培养能够分化为神经元细胞的肿瘤细胞；和b)在具有100至270mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度，并且包含(i)B27补充物和/或(ii)N2补充物的分化培养基中培养a)的经引发神经元分化的肿瘤细胞至少3天，从而获得神经毒素敏感的、神经元分化的细胞。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：KH·艾泽勒，
申请(专利权)人：莫茨制药有限及两合公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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