用于鉴定和分离表达多肽的细胞的方法技术

本发明专利技术涉及新型多肽和包含所述多肽的细胞。所述多肽和细胞用于鉴定和/或分离产生具有特定生物功能的蛋白质的细胞的方法中。具体地，所述方法可用于鉴定、选择和分离产生抗原特异性单克隆抗体的细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术的领域总体上涉及新型多肽和包含所述多肽的细胞。本专利技术还涉及在鉴定和/或分离表达多肽的细胞的方法中使用所述多肽。所述方法可用于鉴定和分离产生抗原特异性单克隆抗体的细胞。
技术介绍
自1970年代单克隆抗体技术发展以来，单克隆抗体已成为日益重要的治疗剂种类。杂交瘤技术仍然是用于生成单克隆抗体的最常用方法。单克隆抗体从通过将正常抗体生成B-细胞与永生化骨髓瘤细胞或其它永生化细胞融合产生的杂交瘤细胞分泌。单克隆抗体产生的过程通常包括几轮筛选上清液以鉴定生成结合目标抗原的抗体的杂交瘤。生成针对目标抗原的单克隆抗体的杂交瘤的鉴定通常通过ELISA筛选来完成。可筛选由来自杂交瘤文库的随机杂交瘤克隆的混合物生成的上清液。该方法具有局限性，因为其接着必须通过有限稀释阳性混合物(positive pool)以分离单个克隆，随后所有克隆需要进行再筛选。在一些情况下，通过作为生成非常大量单一克隆的第一步骤进行有限稀释来克隆杂交瘤文库，以进行筛选。包括有限稀释步骤的任何方法是有问题的，因为其是极其费时费力的。此外，在一些情况下，期望的克隆可代表杂交瘤文库的极低百分比，这使得稀少克隆的鉴定十分困难。此外，ELISA筛选法鉴定对单个抗原的结合活性。为了确定单克隆抗体是否结合超过一种抗原，必须利用不同的个别抗原进行多个连续ELISA筛选。如果生成抗体的细胞以允许抗体生成细胞本身被直接鉴定的形式(例如，在细胞的表面上)保留抗体，则这是有利的。该策略是噬菌体展示技术一直如此成功的原因之一。事实上，正常B-细胞产生膜结合免疫球蛋白并且该分子是响应与抗原的结合发出信号的B-细胞受体复合物的核心组分。天然膜结合抗体的存在先前已被用于试图直接分离杂交瘤(参见，Parks等人1979，PNAS，76:1962-1966)。然而，极低水平的膜结合抗体限制了方法的使用。已开发了几个其它技术来进一步完成该目标。一个方法是“分泌捕获报告网(secretion capture report web) ”(SCRW),其将细胞封装在生物素化的琼脂糖微滴中，随后将微滴悬浮物与抗生物素蛋白和生物素化的抗-小鼠IgG继续温育。抗生物素蛋白用作生物素化的琼脂糖与生物素化的抗-小鼠抗体之间的桥梁以在微滴内形成捕获位点来捕获由细胞分泌的抗体。可筛选此类含抗体的微滴结合报道分子(例如，荧光标记的抗原)的能力并且可利用流式细胞术分离所述微滴。(参见，Kenney等人，1995, NatureBiotechnology 8:787-90 ;Gray 等人，1995, J. Immunol. Methods 182:155-63)。其它方法基于瞬时捕获分泌的蛋白质或细胞表面上的抗体的能力。可通过报道分子(例如，荧光标记抗原)的结合检测细胞表面上的“捕获的”蛋白质或抗体并且例如通过流式细胞术(参见，例如，美国专利No. 6，919，183和7，166，423 ;美国专利申请No. 2010/0009866)进行分离。此类技术的每一个技术具有局限性。琼脂糖微滴技术在技术上存在困难并且需要专门的设备来产生琼脂糖微滴。此外，细胞可能对封装过程敏感。细胞表面捕获法不能完全区分由目标杂交瘤细胞生成的抗体与由其它杂交瘤细胞生成的抗体。相邻细胞之间的目标抗体或蛋白质的扩散可以是个问题。例如，抗体可与与生成其的细胞上的捕获分子分离并且扩散至生成不同抗体的细胞并且被该细胞“捕获”。因此，在一些情况下，所述方法需要高度粘稠的培养基来减少蛋白质或抗体从表达细胞的扩散。此外，实际上，并非所有由杂交瘤生成的抗体都被捕获在细胞表面上，该过量抗体被分泌入培养基中，在培养基中其容易结合其它随机杂交瘤细胞上的捕获分子。因此，需要用于鉴定和选择生成抗原特异性单克隆抗体的细胞的新型和/或改进的方法。专利技术概要本专利技术描述了新型多肽和包含所述多肽的细胞以及使用所述多肽、细胞和细胞文 库鉴定和/或分离生成所述多肽的细胞的方法。具体地，所述方法可用于鉴定和分离生成抗原特异性单克隆抗体的细胞。本专利技术提供了其中包含单个抗原结合位点的膜结合的异二聚体分子在细胞表面上表达的方法。单个抗原结合位点代表了由细胞生成的抗体的结合特异性。异二聚体分子不“结合”分泌的抗体，因此，对于由一个细胞生成的结合在或存在于另一个细胞的表面上的抗体问题有限或无问题。本文中描述的方法和构建体称为“膜_MAb”或“膜-MAb技术”和“膜-MAb构建体”。新型多肽构建体包含多肽，所述多肽包含来自免疫球蛋白或非免疫球蛋白的二聚化结构域和跨膜区。在一些实施方案中，新型多肽构建体包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区和来自免疫球蛋白或非免疫球蛋白的跨膜区。在一些实施方案中，新型多肽构建体包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区和GPI (糖基磷酯酰肌醇)_膜锚着点。当细胞表达多肽和例如免疫球蛋白重链时，多肽缔合以生成包含在细胞表面上表达的单价抗体的异二聚体分子。异二聚体分子不是抗体结合蛋白，这样其不结合或捕获分泌的抗体。膜-MAb策略的非限定性实例描述于图IC中。可将这与常规杂交瘤技术(附图说明图1A)和表面捕获法的实例(图1B)相比较。在一个方面，本专利技术提供了能够与第二多肽形成异二聚体分子的多肽，其中首先多肽是膜结合的并且异二聚体分子在细胞表面上表达。在一些实施方案中，多肽包含(a)含有二聚化结构域的细胞外部分和(b)跨膜部分。在一些实施方案中，二聚化结构域可包括但不限于Fe区域、免疫球蛋白恒定区、亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链。在一些实施方案中，二聚化结构域可获自受体、整联蛋白或通常形成二聚化或多聚化结构的任何分子。二聚化结构域可获自例如免疫球蛋白、LFA-1、GPIIIb/IIIa)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3 (NT-3)、白细胞介素-8 (IL-8)、IL-8受体、血管内皮生长因子(VEGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、Fos, Jun, NFkB, Ras, Raf、CD4、Bcl_2、Myc 和 Met。在一些实施方案中，多肽包含(a)含有免疫球蛋白重链恒定区的细胞外部分和(b)跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含(a)细胞外部分，其包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区；和(b)非-免疫球蛋白跨膜部分。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区包含铰链区、CH2和CH3结构域的至少一部分。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区包含Fe区域。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区来自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗体或其亚型。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区来自IgGl或IgG2抗体。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区为小鼠免疫球蛋白重链恒定区。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区为人免疫球蛋白重链恒定区。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区包含SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，本专利技术的多肽包含跨膜部分。在一些实施方案中，跨膜部分包含来自免疫球蛋白或非-免疫球蛋白的跨膜结构域的至少一部分。在一些实施方案中，跨膜部分来自人蛋白质。在某些实施方案中，跨膜部分来自小鼠蛋白质。在一些实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.02.12 US 61/304,251;2011.01.31 US 61/437,8891.一种多肽,其包含 (a)包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区的细胞外部分；和 (b)非免疫球蛋白跨膜部分。2.权利要求I所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重链恒定区还包含至少一部分铰链区。3.权利要求I或2所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重链恒定区包含Fe区域。4.权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重链恒定区为IgA、IgD、IgE、IgG、IgM或它们的亚型的任ー个。5.权利要求1-4中任一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重链恒定区为IgGl或IgG2。6.权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重链恒定区为人免疫球蛋白重链恒定区。7.权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重链恒定区为小鼠免疫球蛋白重链恒定区。8.权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重链恒定区包含SEQIDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6 或 SEQ ID NO:8。9.权利要求1-8中任一项所述的多肽，其中所述跨膜部分包含至少一部分选自CD4、CD8、I 类 MHC、II 类 MHC、CD19、T-细胞受体 α 链和 β 链、CD3、ζ 链、ICAMl (CD54)、ICAM2、ICAM3、ICAM4、ICAM5、CD28、CD79a、CD79b 和 CD2 的跨膜结构域。10.权利要求1-9中任一项所述的多肽，其中所述跨膜部分包含SEQID NO: 13或SEQID NO:16。11.权利要求ι- ο中任一项所述的多肽，其为膜结合的并且其中所述免疫球蛋白重链区域在细胞的表面上表达。12.权利要求1-11中任一项所述的多肽，其不具有抗原结合位点。13.权利要求1-12中任一项所述的多肽，其能够与第二多肽形成异ニ聚体分子。14.权利要求13所述的多肽，其中所述第二多肽包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区。15.权利要求13或14所述的多肽，其中所述第二多肽包含免疫球蛋白Fe区域。16.权利要求13-15中任一项所述的多肽，其中所述第二多肽包含随机化的多肽。17.权利要求13所述的多肽，其中所述第二多肽包含免疫球蛋白重链。18.权利要求17所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链缔合。19.权利要求13-18中任一项所述的多肽，其中所述第二多肽包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白。20.权利要求13-19中任一项所述的多肽，其能够与第二多肽形成至少ー个ニ硫键。21.权利要求1-12中任一项所述的多肽，其能够与免疫球蛋白重链-轻链对的重链区域形成至少ー个ニ硫键以形成异ニ聚体抗体分子。22.权利要求13-21中任一项所述的多肽，其中所述异ニ聚体抗体分子包含ー个抗原结合位点。23.权利要求1-22中任一项所述的多肽，其不结合分泌的抗体。24.一种多肽，其包含与 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31 或 SEQ ID NO: 32 具有至少 80%同一性的序列。25.一种多肽，其包括SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31 或 SEQ ID NO:32。26.一种多肽，其包含与 SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 或 SEQ ID NO:32 具有至少 80%同一性的序列。27.一种多肽，其包括 SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31 或 SEQ ID NO:32。28.一种多肽，其基本上由 SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31 或 SEQ ID NO:32 组成。29.一种多肽，其包含由 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27 或 SEQ ID NO:29 编码的序列。30.ー种抗体分子，其包含权利要求1-29中任一项所述的多肽。31.权利要求30所述的抗体分子，还包含 (a)免疫球蛋白重链；和 (b)免疫球蛋白轻链。32.权利要求30或31所述的抗体分子，其中所述多肽与免疫球蛋白重链-轻链对的Fe区域形成至少ー个ニ硫键。33.权利要求30-32中任一项所述的抗体分子，其包含单个抗原结合位点。34.—种多核苷酸,其编码权利要求1-29中任一项所述的多肽。35.一种分离的多核苷酸，其包含与 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:24, SEQID NO:25, SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29具有至少80%同一性的序列的多核苷酸。36.一种分离的多核苷酸，其包含序列SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: IUSEQ ID NO:24,SEQID NO: 25、SEQ ID NO: 27 或 SEQ ID NO: 29 的多核苷酸。37.ー种载体,其包含权利要求34-36中任一项所述的多核苷酸。38.ー种宿主细胞,其包含权利要求34-37中任一项所述的多核苷酸或载体。39.ー种宿主细胞，其包含权利要求1-33中任一项所述的多肽或抗体分子。40.—种产生宿主细胞的方法,包括用权利要求34-37中任一项所述的多核苷酸或载体转染细胞。41.权利要求40所述的方法，其中所述转染的细胞表达所述多肽。42.权利要求40或41所述的方法，其中瞬时转染所述细胞。43.权利要求40或41所述的方法，其中稳定地转染所述细胞。44.权利要求40所述的方法，其中将编码多肽的所述多核苷酸整合入所述细胞的基因组。45.权利要求40、41、43或44中任一项所述的方法，其中稳定地表达编码所述多肽的所述多核苷酸。46.权利要求40-45中任一项所述的方法，其中在所述细胞的表面上表达所述多肽。47.权利要求40-46中任一项所述的方法，包括检测多肽在所述细胞表面上的表达。48.权利要求40-47中任一项所述的方法，包括分离在所述细胞的表面上表达所述多肽的细胞。49.权利要求40-48中任一项所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。50.权利要求40-49中任一项所述的方法，其中所述细胞为鼠细胞。51.权利要求40-49中任一项所述的方法，其中所述细胞为人细胞。52.权利要求40-51中任一项所述的方法，其中所述细胞为融合伴侣细胞系。53.权利要求40-48中任一项所述的方法，其中所述细胞选自Sp2/0、Sp2/0_Agl4、YB2/0、K6H6/B5、NS-1、F0、Y3/Ag I. 2. 3、P3X63Ag8. 653、HEK_293、293T 和 CHO。54.—种宿主细胞，其通过权利要求40-53中任一项所述的方法制备。55.—种宿主细胞,其包含权利要求34-37所述的多核苷酸或载体。56.—种宿主细胞,其包含权利要求1-33中任一项所述的多肽或抗体分子。57.—种宿主细胞,其表达权利要求1-33中任一项所述的多肽或抗体分子。58.权利要求54-57中任一项所述的宿主细胞，其还包含至少ー种额外的多肽。59.权利要求58所述的宿主细胞，其中所述至少ー种额外的多肽包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区。60.权利要求58所述的宿主细胞，其中所述至少ー种额外的多肽包含免疫球蛋白Fe区域。61.权利要求58所述的宿主细胞，其中所述至少ー种额外的多肽包含免疫球蛋白重链。62.权利要求58-61中任一项所述的宿主细胞，其中所述至少ー种额外的多肽包含免疫 球蛋白轻链。63.权利要求58所述的宿主细胞，其中所述至少ー种额外的多肽包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链抗体。64.权利要求58-63中任一项所述的宿主细胞，其中所述至少ー种额外的多肽为抗体。65.权利要求58-64中任一项所述的宿主细胞，其中所述多肽与第二多肽形成至少ー个ニ硫键以形成异ニ聚体分子。66.权利要求58-65中任一项所述的宿主细胞，其中所述多肽与免疫球蛋白重链-轻链对形成至少ー个ニ硫键以形成异ニ聚体抗体分子。67.权利要求66所述的宿主细胞，其中所述免疫球蛋白重链-轻链对形成单个抗原结合位点。68.权利要求65-67中任一项所述的宿主细胞,其中所述异ニ聚体分子在所述细胞的表面上表达并且包含单个抗原结合位点。69.权利要求65-68中任一项所述的宿主细胞,其中所述异ニ聚体分子不结合分泌的抗体。70.一种产生杂交瘤细胞的方法，包括将权利要求54-57中任一项所述的细胞与抗体生成细胞融合。71.权利要求70所述的方法，其中所述融合细胞在所述细胞表面上表达异ニ聚体抗体分子。72.权利要求70或71所述的方法，其中所述抗体生成细胞是抗体生成细胞的群体。73.权利要求70-72中任一项所述的方法，其中所述抗体生成细胞来自免疫动物。74.权利要求70-72中任一项所述的方法，其中所述抗体生成细胞来自初次接触实验的动物。75.权利要求70-74中任一项所述的方法，其中所述抗体生成细胞选自B-细胞、浆细胞、杂交瘤、骨髄瘤和重组细胞。76.权利要求70-75中任一项所述的方法，其中所述抗体生成细胞为小鼠细胞，77.权利要求70-75中任一项所述的方法，其中所述抗体生成细胞为人细胞。78.权利要求70-77中任一项所述的方法，其中所述抗体生成细胞包含多种多核苷酸。79.权利要求78所述的方法，其中所述多种多核苷酸编码多种包含免疫球蛋白重链的多肽。80.权利要求78或79所述的方法，其中所述多种多核苷酸编码多种包含免疫球蛋白轻链的多肽。81.权利要求78或79所述的方法，其中所述多种多核苷酸编码多种包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链抗体分子的多肽。82.权利要求78-81中任一项所述的方法，其中所述多种多核苷酸包含DNA文库。83.权利要求82所述的方法，其中所述DNA文库产生自免疫动物的细胞。84.权利要求82所述的方法，其中所述DNA文库为天然文库。85.权利要求82-84中任一项所述的方法，其中所述DNA文库为cDNA文库。86.权利要求70-85中任一项所述的方法，其中所述融合细胞包含表达多种异ニ聚体抗体分子的杂交瘤细胞的群体。87.—种杂交瘤或杂交瘤文库,其通过权利要求70-86所述的方法的任一方法制备。88.—种产生细胞文库的方法，包括用编码多种多肽的多种多核苷酸转染权利要求54-57中任一项所述的细胞。89.权利要求88所述的方法，其中所述转染的细胞表达异ニ聚体分子。90.权利要求89所述的方法，其中所述异ニ聚体分子在所述转染的细胞的表面上表达。91.权利要求88-90中任一项所述的方法，其中所述多种多核苷酸编码多种包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区的多肽。92.权利要求88-90中任一项所述的方法，其中所述多种多核苷酸编码多种包含免疫球蛋白Fe区域的多肽。93.权利要求88-90中任一项所述的方法，其中所述多种多核苷酸编码多种包含免疫球蛋白重链的多肽。94.权利要求88-93中任一项所述的方法，其中所述多种多核苷酸编码多种包含免疫球蛋白轻链的多肽。95.权利要求88-90中任一项所述的方法，其中所述多种多核苷酸编码多种包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链抗体分子的多肽。96.权利要求88-90中任一项所述的方法，其中所述多种多核苷酸编码多种多肽，其中每ー种多肽包含(a)免疫球蛋白Fe区域和(b)随机化的多肽。97.权利要求88-96中任一项所述的方法，其中所述多种多核苷酸包含DNA文库。98.权利要求97所述的方法，其中从免疫动物的细胞产生所述DNA文库。99.权利要求97所述的方法，其中所述DNA文库是天然文库。100.权利要求97-99中任一项所述的方法，其中所述DNA文库为cDNA文库。101.权利要求97所述的方法，其中所述DNA文库编码随机多肽文库。102.ー种细胞文库，其通过权利要求88-101所述的方法的任一方法制备。103.一种鉴定生成特异性抗体的细胞的方法，包括将权利要求54-57中任一项所述的细胞与抗体生成细胞融合以产生杂交瘤细胞的群体。104.权利要求103所述的方法，其中所述杂交瘤细胞在所述细胞表面上表达异ニ聚体抗体分子。105.权利要求103或104所述的方法，包括将杂交瘤细胞的群体与检测分子接触...

【专利技术属性】
技术研发人员：奥斯丁·L·格尼，A·L·L·拉兹提克，C·J·邦德，
申请(专利权)人：昂考梅德药品有限公司，
类型：
国别省市：