【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及重组微藻细胞及其在异源多肽生产中的用途，在微藻胞外体中生产异源多肽的方法，包含异源多肽的微藻胞外体，以及包含它们的组合物。
技术介绍
生物技术和分子生物学的进步使在微生物、植物和动物细胞中生产蛋白成为可能，其中许多蛋白以前只能通过从人类和其它动物的组织、血液或尿液中提取。如今市售的生物制剂通常在哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或在微生物细胞，例如酵母或大肠杆囷细胞系中制备。通过微生物发酵生产蛋白相对于现有的系统，例如植物和动物细胞培养呈现几项优势。例如，基于微生物发酵的方法可以提供(i)高浓度蛋白的快速生产；(ii)使用无菌、充分受控的生产条件(例如良好生产规范(GMP)的条件)的能力；(iii)使用简单、化学上确定成分的生长培养基以允许更简单的发酵和更少杂质的能力；(iv)人或动物病原体污染的规避；(ν)易于回收蛋白(例如通过从发酵培养基中分离)。此外，发酵设施通常比细胞培养设施建设的成本更低。微藻，例如网粘菌门(Labyrinthulomycota)的破囊壶菌(thraustochytrids),能够以标准的发酵设备，非常短的培养周期(例如，1-5天)，低廉的确定成分培养基和最低限度的纯化(如果有的话)进行培养。此外，某些微藻，例如裂殖壶菌属(Schizochytrium),其生物质及自其衍生的脂质具有已经证明的用于食品应用的安全历史。例如，来自此类微生物的富含DHA的甘油三酯油已获得美国食品和药物管理局的GRAS( —般认为安全)状态。微藻已被证明能够表达重组蛋白。例如，美国专利第7，001，772号公开了第一个适于转...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.28 US 61/290,441;2009.12.28 US 61/290,469;中任一项所述的胞外体和含水液体载体的组合物。在一些实施方案中，含水液体载体是培养上清。附图简述 图I 显不了编码甲型流感病毒(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (HlNl))血凝素(HA)蛋白的多核苷酸序列(SEQ ID NO:76)，其经密码子优化以供在裂殖壶菌属菌种ATCC 20888 中表达。图2显示了 pCL0143的质粒图谱。图3显示了用于分析CL0143-9克隆的流程。图4显示了转基因裂殖壶菌属CL0143_9( “E”)进行的HA蛋白的分泌。图4A显示了在抗HlNl免疫印迹中从不同温度(25° C、27。C、29。C)和ρΗ(5· 5、6· 0、6· 5、7· O)的培养物的低速上清(即无细胞上清(“CFS”))回收的重组HA蛋白(如箭头所示)。图4Β显示了在非还原或还原条件下从60%蔗糖级分的抗-HlNl免疫印迹(“IB :抗-H1N1”)和考马斯染色凝胶(“考马斯”)回收的重组HA蛋白。图5显示了来自转基因裂殖壶菌属CL0143_9( “E”)的重组HA蛋白的血凝素活性。图5A显示了无细胞上清(“CFS”)中的血凝素活性。图5B显示了在可溶(“US”)和不溶性(“UP”)级分中的血凝素活性。“[蛋白质]”指蛋白质的浓度，随样品稀释增加而从左至右降低。指缺乏HA的阴性对照。“ + ”指流感血凝素阳性对照。“C”指阴性对照裂殖壶菌属菌种ATCC 20888野生型菌株。“HAU”指基于从左至右的样品倍数稀释的血凝素活性单位。“2”指第一孔中的2倍稀释的样品；从左至右的随后的孔代表在前一孔之上的加倍稀释，从而使从左至右从第一孔到最后的孔的倍数稀释是2、4、8、16、32、64、128、256、512,1024,2048 和 4096。图6显示了存在于转基因裂殖壶菌属CL0143_9( “E”)60%蔗糖级分中的HA蛋白的表达和血凝素活性。图6A显示了考马斯染色凝胶(“考马斯”)和抗-HlNl免疫印迹(“IB :抗-H1N1”)中所示的来自60%鹿糖级分的回收的重组HA蛋白(如箭头所示)。图6B显示了相应的血凝素活性。指缺乏HA的阴性对照。“ + ”指流感HA蛋白阳性对照。“C”指阴性对照裂殖壶菌属菌种ATCC20888野生型菌株。“HAU”指基于样品倍数稀释的血凝素活性单位。图7显示了回收的重组HA蛋白的肽序列分析，这是通过覆盖完整HA蛋白序列(SEQ ID NO: 77)超过42%的共27条肽(与肽相关的氨基酸以粗体突出显示)确定的。HAl多肽由总共17条肽确定，而HA2多肽由总共9条肽确定。[0025]图8显示了例示裂殖壶菌属中HA蛋白糖基化的考马斯染色凝胶(“考马斯”)和抗-HlNl免疫印迹(“IB :抗-HlNOJEndoHlfPNGase F”指转基因裂殖壶菌属CL0143-9的60%蔗糖级分使用各种酶的酶处理。“NT”指不用酶温育但在与EndoH和PGNase F处理相同条件下的转基因裂殖壶菌属CL0143-9。图9显示了对应于时间(小时)的全部裂殖壶菌属菌种ATCC 20888培养上清蛋白(g/L)。图10在11-15泳道显示了全部裂殖壶菌属菌种ATCC 20888培养上清蛋白的SDS-PAGE，其中在如图9所示第37-68小时中的6个时间点中的五个，除了第52小时，收集了上清。鉴定为肌动蛋白或凝溶胶蛋白的条带(通过质谱肽测序)以箭头标记。泳道11以2. 4 μ g总蛋白上样，其余孔以5 μ g总蛋白上样。图11显示了来自裂殖壶菌属菌种ATCC 20888 (〃C: 20888〃)和转基因裂殖壶菌属CL0143-9(〃E:CL0143-9〃)负染色的囊泡。 图12显示了来自裂殖壶菌属菌种ATCC 20888 (〃C: 20888〃)和转基因裂殖壶菌属CL0143-9(〃E:CL0143-9〃)的抗-HlNl免疫金标记的囊泡。图13显示了基于使用SignalP算法预测的裂殖壶菌属天然的信号锚序列。参见，例如，Bendsten 等,J. Mol. Biol. 340:783-795 (2004) ；Nielsen, H.和 Krogh, A. Proc. Int.Conf.Inte11.Syst. MoI. Biol. 6:122-130(1998) ；Nielsen, H.等，Protein Engineering12:3-9 (1999) ；Emanuelsson, 0.等，Nature Protocols〗953-971 (2007)。 图14显示了预测的裂殖壶菌属中的I型膜蛋白，其是基于针对与来自其它生物的已知I型膜蛋白具有同源性并在蛋白的极C-端区具有跨膜区的基因，对裂殖壶菌属基因组和EST DNA数据库进行BLAST检索。图15显示了 pCL0120的质粒图谱。图16显不了裂殖壶菌属的密码子选择表。图17显示了 pCL0130的质粒图谱。图18显示了 pCL0131的质粒图谱。图19显示了 pCL0121的质粒图谱。图20显示了 pCL0122的质粒图谱。图21显示了为在裂殖壶菌属菌种ATCC 20888中表达优化的编码瘤胃真菌属菌种(Piromyces sp. )E2木糖异构酶蛋白“XylA”的多核苷酸序列(SEQ ID N0:92)，对应于GenBank 登录号 CAB76571。图22显示了为在裂殖壶菌属菌种ATCC 20888中表达优化的编码瘤胃真菌属菌种E2木酮糖激酶蛋白“XylB”的多核苷酸序列(SEQ ID NO:93)，对应于GenBank登录号AJ249910。图23显示了 pCL0132的质粒图谱。图24显示了 pCL0136的质粒图谱。图25A显示了 pCL0140的质粒图谱而图25B显示了 pCL0149的质粒图谱。图26A显示了为在裂殖壶菌属菌种ATCC 20888中表达优化的编码甲型流感病毒(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (HlNl))的神经氨酸酶(NA)蛋白的多核苷酸序列(SEQID NO: 100)。图26B显示了为在裂殖壶菌属菌种ATCC20888中表达优化的编码甲型流感病毒(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(HlNl))的NA蛋白，接有V5标签和多聚组氨酸标签的多核苷酸序列(SEQ ID NO: 101)。图27显示了用于分析CL0140和CL0149克隆的流程表。图28显示了来自转基因裂殖壶菌属菌株CL0140-16，-17，-20，-21，-22，-23，-24，-26，-28的重组NA的神经氨酸酶活性。通过测量4-甲基伞形酮的荧光来测定活性，所述突光在唾液酸酶水解(4-甲基伞形酮)-a -D-N-乙酰神经氨酸(4-methylumbelliferyl)-a -D-N-Acetylneuraminate; 4-MUNANA)之后产生(激发(Exc) :365nm,发射(Em) :450nm)。以浓缩的无细胞上清(cCFS，每个克隆最左边的柱)和无细胞提取物(CFE，每个克隆最右边的柱)中每μ g蛋白的相对荧光单位(RFU)来表示活性。与转基因菌株以相同方式培养和制备的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888野生型菌株和 用pCL0140转化的裂殖壶菌属的PCR阴性菌株(“27”)用作阴性对照。图29显示了来自转基因裂殖壶菌属菌株CL0140-26的重组NA蛋白的部分纯化。各级分的神经氨酸酶活性如图29A所示。“cCFS”指浓缩的无细胞上清。“D”指以洗涤缓冲液稀释的cCFS，“FT”指流过物(flow-through)，“W，，指洗液，“E”指洗脱液和“cE”指浓缩的洗脱级分。每级分12. 5 μ L的考马斯染色凝胶(“考马斯”)如图29Β所示。箭头指向鉴定为NA蛋白的条带。以M0PSSDS运行缓冲液在_/瘦./(:正初Novex 12%的bis-tris凝胶上使用SDS-PAGE分离蛋白。图30显示了回收的重组NA蛋白的肽序列分析，NA蛋白是通过覆盖蛋白序列(SEQID NO: 10) 25%的共9条肽(以粗红突出显示)确定的。图31显示了转基因裂殖壶菌属菌株CL0149-10，-11，-12的神经氨酸酶活性和对应的考马斯染色凝胶(“考马斯”)和抗-V5免疫印迹(“免疫印迹抗-V5”)。图31A显示了神经氨酸酶活性，如通过测量4-甲基伞形酮的荧光来测定的，荧光在唾液酸酶水解4-MUNANA之后产生(激发(Exc) :365nm，发射(Em) :450nm)。以无细胞上清(CFS)中每μ g蛋白的相对荧光单位(RFU)来表示活性。将与转基因菌株以相同方式培养和制备的裂殖壶菌属菌种ATCC20888野生型菌株用作阴性对照。图31B显示了 3株转基因裂殖壶菌属CL0149菌株(“10”、“11”、和“12”)的12. 5μ L CFS的考马斯染色凝胶和对应的抗_V5免疫印迹。将Positope 抗体对照蛋白用作阳性对照(“ + ”)。将与转基因菌株以相同方式培养和制备的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888野生型菌株(用作阴性对照。图32显示了用CL0140和CL0143共转化的转基因裂殖壶菌属的无细胞上清中的流感HA 和 NA 的酶活性。显示了克隆 CL0140-143-l、-3、-7、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19>-20的数据。图32A显示了神经氨酸酶活性，如通过测量4-甲基伞形酮的荧光来测定的，所述荧光由唾液酸酶水解4-MUNANA之后产生(激发(Exc) :365nm，发射(Em) :450nm)。以25 μ L CFS中的相对荧光单位(RFU)来表示活性。将与转基因菌株以相同方式培养和制备的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888野生型菌株用作阴性对照。图32Β显示了血凝素活性。指缺少HA的阴性对照。“ + ”指流感HA阳性对照。“HAU”指基于样品倍数稀释的血凝素活性单位。发明详述本发明涉及在微藻宿主细胞中生产异源多肽的方法。本发明也涉及所述方法产生的异源多肽、包含所述异源多肽的微藻细胞、和包含所述异源多肽的组合物。本发明也涉及在微藻宿主细胞中异源多肽的产生，其中所述异源多肽与微藻胞外体相关，所述微藻胞外体与宿主细胞质膜是不连续的。本发明也涉及包含异源多肽的微藻胞外体的产生，以及包含它们的组合物的产生。本发明进一步涉及包含异源多肽的微藻胞外体、组合物及其用途。微藻宿主细胞微藻，又称微小藻类(miciOscopic algae)，经常发现于淡水和海洋系统。微藻是单细胞的但也可以生长成链和组。单个细胞的大小从几微米到几百微米。因为细胞能够生长在含水悬液中，它们能有效地获得营养和进入液体环境。在一些实施方案中，微藻宿主细胞是不等鞭毛体(heterokont)或原生藻菌(stramenopile)。在一些实施方案中，微藻宿主细胞是网粘菌门(Labyrinthulomycota)成员。在一些实施方案中，网粘菌门宿主细胞是破囊壶菌目(Thraustochytriales)或网粘菌目(Labyrinthulales)成员。根据本发明，术语“破囊壶菌(thraustochytrid) ”是指破囊壶 菌目(Thraustochytriales)的任何成员，包括破囊壶菌科(Thraustochytriaceae),而术语“网粘菌(Iabyrinthulid) ”是指网粘菌目(Labyrinthulales)的任何成员，包括网粘菌科(Labyrinthulaceae)。网粘菌科的成员从前曾被认为是破囊壶菌目的成员，但是在最近此类生物体的分类学归类的修订版中，网粘菌科现在被认为是网粘菌目的成员。网粘菌目和破囊壶菌目均被认为是网粘菌门的成员。分类学理论现在通常将这两个群的微生物与原生藻菌世系中的藻或藻样原生生物放在一起。破囊壶菌和网粘菌当前的分类学地位可以归纳如下界藻菌界(Stramenopila)(管毛生物界(Chromista))门网粘菌门(Labyrinthulomycota)(不等毛门(Heterokonta))纲网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)(Labyrinthulae)目网粘菌目(Labyrinthulales)科网粘菌科(Labyrinthulaceae)目破囊壶菌目(Thraustochytriales)科破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)对于本发明的目的而言，作为破囊壶菌描述的菌株包括如下生物体目破囊壶菌目；科破囊壶菌科；属破囊壶菌属(种菌种，arudimentale, aureum, benthicola,globosum, kinnei, motivum, multirudimentale, pachydermum, proliferum, roseum,striatum)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)(种菌种，amoeboidea, kerguelensis, minuta,profunda, radiata, sailens, sarkariana, schizochytrops, visurgensis, yorkensis)、裂殖壶菌属(种菌种，aggregatum, limnaceum, mangrove i, minutum, octosporum),Japonochytrium 属(种菌种，marinum)、Aplanochytrium 属(种菌种，haliotidis,kerguelensis, profunda, stocchinoi)、Althornia 属(种菌种，crouchii)、或 Elina 属(种菌种，marisalba, sinorifica)。出于本发明的目的,吾肯氏壶菌属中描述的物种将被看作是破囊壶菌属的成员 ° Aurantiochytrium、Oblongichytrium> Botryochytrium、Parietichytrium、和Sicyoidochytrium是本发明网粘菌门包括的额外的属。本发明作为网粘菌描述的菌株包括如下生物体目网粘菌目，科网粘菌科，属网粘菌属(种菌种，algeriensis, coenocystis, chattonii, macrocystis, macrocystisatlantica, macrocystis macrocystis, marina, minuta, roscoffensis, valkanovii,vitellina, vitellina pacifica, vitellina vitellina, zopfii), Labyrinthuloides 属(种菌种，haliotidis, yorkensis), Labyrinthomyxa 属(种菌种，marina), Diplophrys属(种菌种，archeri)，Pyrrhosorus 属(种菌种，marinus)， Sorodiplophrys 属(种菌种，stercorea)或 Chlamydomyxa 属(种菌种，labyrinthuloides, montana)(尽管关于Pyrrhosorus>Sorodiplophrys或Chlamydomyxa的精确分类学地位目前尚没有达成一致)。网粘菌门的微藻细胞包括但不限于保藏菌株PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、PTA-9695、PTA-9696、PTA-9697、PTA-9698、PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210、PTA-10211、以SAM2179保藏的微生物(保藏者命名为“吾肯氏壶菌SAM2179”)、任何破囊壶菌属菌种(包括前述的吾肯氏壶菌属菌种，例如U. visurgensis, U. amoeboida,U. sarkariana, U. profunda, U radiata, U. minuta 和吾肯氏壶菌菌种 BP-5601),并且包括Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum ;和任何Japonochytrium属菌种。破囊壶菌目菌株包括但不限于破囊壶菌属菌种(23B) (ATCC20891) ；Thraustochytrium striatum(Schneider)(ATCC 24473) ；Thraustochytrium aureum(Goldstein)(ATCC 34304) ；Thraustochytrium roseum(Goldstein)(ATCC 28210)；和Japonochytrium属菌种(LI) (ATCC 28207)。裂殖壶菌属包括但不限于Schizochytriumaggregatum, Schizochytrium Iimacinum,裂殖壶菌属菌种(S31) (ATCC 20888),裂殖壶菌属菌种(S8)(ATCC 20889)，裂殖壶菌属菌种(LC-RM) (ATCC 18915)，裂殖壶菌属菌种(SR21)，保藏菌株 ATCC 28209,和保藏的 Schizochytrium Iimacinum 菌株 IFO 32693。在一些实施方案中，细胞是裂殖壶菌属(Schizochytrium)或破囊壶菌属(Thraustochytrium)的。裂殖壶菌属能够通过连续二等分裂和通过形成孢子囊两种方式复制，最终释放游动孢子。但是，破囊壶菌属仅通过形成孢子囊复制，然后释放游动孢子。在一些实施方案中，微藻宿主细胞是网粘菌纲(也称作Labyrinthulomycetes)。网粘菌纲产生特有的结构称为“质外网”(ectoplasmic nets)。这些结构是质膜分叉的、管状的延伸物，极大地有助于增加质膜的表面积。参见，例如，Perkins, Arch.Mikrobiol. 84:95-118(1972) ;Perkins, Can. J. Bot. 51:485-491 (1973)。质外网是从称为sagenosome或生网体(bothrosome)的独特的细胞结构形成的。质外网将网粘菌纲细胞附着于表面并能够穿过表面。分别参见，例如，Coleman和Vestal, Can.J. Microbiol. 33:841-843(1987)，和 Porter, Mycologia 84:298-299(1992)。例如，已经观察到裂殖壶菌属菌种ATCC 20888当在固体培养基上培养时，产生延伸到琼脂中的质外网(数据未显示)。在此情况下质外网看起来充当类伪根(pseudorhizoid)。此外，在某些质外网膜延伸中发现丰富的肌动蛋白纤丝。参见，例如，Preston, J. Eukatyot.Microbiol. 52:461-475(2005)。基于肌动蛋白纤丝在其他生物的细胞骨架结构中的重要性，预计例如肌动蛋白的细胞骨架元件在质外网膜延伸的形成和/或完整性中发挥作用。产生类伪根延伸的其他生物包括称为壶菌(chytrids)的生物，分类学上将这些生物分类在包括壶菌门(Chytridiomycota)或须霉属(Phycomyces)的各组中。属的例子包括 Chytrdium> Chytrimyces> Cladochytium> LacustromycesM (Rhizophydium)、Rhisophyctidaceae、Rozella、Olpidium 和 Lobulomyces。在一些实施方案中，微藻宿主细胞包含膜延伸物。在一些实施方案中，微藻宿主细胞包含类伪根。在一些实施方案中，微藻宿主细胞包含质外网。在一些实施方案中，微藻宿主细胞包含sagenosome或生网体。在一些实施方案中，微藻宿主细胞是破囊壶菌。在一些实施方案中，微藻宿主细胞是裂殖32囷属或破囊32囷属细胞。在一些实施方案中，微藻宿主细胞是网粘菌。在一些实施方案中，微藻宿主细胞是能够通过常规分泌途径加工多肽的真核细胞，例如网粘菌门成员，包括裂殖壶菌属、破囊壶菌属和其他破囊壶菌。例如，已经认识到网粘菌门成员比CHO细胞产生更少的丰富分泌的蛋白，导致使用裂殖壶菌比例如CHO细胞具有优势。此外，不像大肠杆菌，网粘菌门成员，例如裂殖壶菌属，进行某些蛋白的生物活性所必需的蛋白糖基化，例如N-联糖基化。已经确定破囊壶菌，例如裂殖壶菌属，展示的N-联糖基化比酵母糖基化更紧密类似于哺乳动物的糖基化模式。用于本发明宿主细胞的有效培养条件包括但不限于允许蛋白产生和/或重组的有效的培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效的培养基指任何通常培养微藻细胞，如破囊壶菌目细胞，例如裂殖壶菌属宿主细胞的培养基。这种培养基通常包含具有可同化的碳、氮、和磷酸盐源、以及适当的盐、无机物、金属和其他营养物质，如维生素的含水培养基。合适的培养基和培养条件的非限制性实例公开在实施例部分。适合破囊壶菌目微生物的非限制性培养条件也描述于，例如，美国专利第5，340, 742号，将其通过提述整体并入本文。本发明的细胞可以培养于常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微滴定板和培养皿中。可以在适于重组细胞的温度、PH和氧含量下进行培养。在一些实施方案中，本发明的微藻宿主细胞含有包含编码选择标记的核酸序列的重组载体。在一些实施方案中，选择标记允许选择经转化的微生物。显性选择标记的例子包括降解具有抗生素或杀真菌活性的化合物的酶，如，例如来自Steptoalloteichushindustanus的编码SEQ ID NO:5所示的“博莱霉素结合蛋白”的Sh ble基因。显性选择标记的另一个例子包括破囊壶菌乙酰乳酸合酶序列，例如SEQ ID N0:6的多核苷酸序列的突变形式。可以修饰、突变或以其他方式选择乙酰乳酸合酶以使其对磺脲类化合物、咪唑啉酮类抑制剂和/或喃唳基氧代苯甲酸酯(pyrimidinyl oxybenzoates)的抑制有抗性。破囊壶菌乙酰乳酸合酶序列的代表性例子包括但不限于如SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9, SEQ ID NO: 10的氨基酸序列，或通过在一个或多个以下位置的氨基酸缺失、插入或取代而不同于 SEQ ID NO:7 的氨基酸序列116G、117A、192P、200A、251K、358M、383D、592V、595W、或599F，和例如SEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 12、或SEQ ID NO: 13的多核苷酸序列，以及与任一代表性序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性的序列。可以包含于用于转化微藻细胞的重组载体的选择标记进一步的例子包括ZE0CIN 、巴龙霉素、潮霉素、杀稻瘟素或任何其他合适的抗性标记。术语“转化”用于指任何一种方法，通过这种方法外源核酸分子(即，重组核酸分子)可被插入微生物细胞。在微生物系统中，术语“转化”用于描述由于微生物获得外源核酸所致的一种遗传性改变而且可基本上与术语“转染”同义。用于将外源核酸分子引入微藻宿主细胞的合适的转化技术包括但不限于，粒子轰击、电穿孔、显微注射、脂转染、吸附、感染和原生质体融合。例如，可以在指数生长期或当微藻细胞在600nm的光密度达到I. 5-2时，将外源核酸分子，包括重组载体，引入处于的静息期的微藻细胞。也可以在通过电穿孔将核酸分子导入宿主细胞前，用具有蛋白酶活性的酶预处理微藻宿主细胞。在一些实施方案中，遗传修饰宿主细胞以引入或缺失涉及与转运和/或合成碳水化合物相关的生物合成途径的基因，包括涉及糖基化的那些。例如，可以通过缺失内源糖基化基因和/或插入人或动物的糖基化基因以允许更紧密类似于人的糖基化模式来修饰宿主细胞。酵母中的糖基化修饰可参见，例如，美国专利第7，029，872号和美国申请公开号2004/0171826，2004/0230042, 2006/0257399, 2006/0029604 和 2006/0040353。本发明的宿主细胞包括其中使用RNA病毒元件来增加或调节基因表达的细胞。表达系统用于在微藻宿主细胞中表达异源多肽的表达系统包含在微藻细胞中有活性的调节性调控元件。在一些实施方案中，表达系统包含在网粘菌门细胞中有活性的调节性调控元件。在一些实施方案中，表达系统包含在破囊壶菌中有活性的调节性调控元件。在一些实施方案中，表达系统包含在裂殖壶菌属或破囊壶菌属中有活性的调节性调控元件。许多调节性调控元件，包括各种启动子，在许多不同物种中具有活性。因此，调节序列可以在与 分离出所述调节序列的细胞相同的细胞类型中应用，或者也可以在与分离出所述调节序列 的细胞不同的细胞类型中应用。这种表达盒的设计和构建使用本领域熟练技术人员已知的标准分子生物学技术。参见，例如，Sambrook 等,2001, Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第三版。在一些实施方案中，用于在微藻细胞中的异源多肽产生的表达系统包含衍生自网粘菌门序列的调节元件。在一些实施方案中，在微藻细胞中用于产生异源多肽的表达系统包含衍生自非网粘菌门序列的调节元件，包括衍生自非网粘菌门藻类序列的序列。在一些实施方案中，表达系统包含编码异源多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列与在微藻宿主细胞中有功能的任何启动子序列、任何终止子序列、和/或任何其他调节序列相关。可以使用诱导性或组成型活性的序列。合适的调节性调控元件也包括与本文描述的核酸分子相关的任何调节性调控元件。本发明也涉及在微藻宿主细胞中用于表达异源多肽的表达盒。本发明也涉及包含在宿主细胞中表达异源多肽的表达盒的任何一种上述宿主细胞。在一些实施方案中，表达系统包含含有遗传元件，例如至少是启动子、编码序列和终止子区的表达盒，它们以在宿主细胞中有功能的方式可操作地连接。在一些实施方案中，表达盒包含至少一种分离的如本发明所述的核酸分子。在一些实施方案中，表达盒的所有遗传兀件是与分尚的核酸分子关联的序列。在一些实施方案中，调控序列是可诱导的序列。在一些实施方案中，编码异源多肽的核酸序列整合到宿主细胞的基因组中。在一些实施方案中，编码异源多肽的核酸序列稳定整合到宿主细胞的基因组中。在一些实施方案中，编码要表达的异源多肽的分离的核酸序列可操作地连接启动子序列和/或终止子序列，在宿主细胞中两者均是有功能的。编码要表达的异源多肽的分离的核酸序列可操作地连接的启动子和/或终止子序列可以包括任何启动子和/或终止子序列，包括但不限于本文公开的核酸序列、美国专利第7，001，772号公开的调节序列、美国申请公开号2006/0275904和2006/0286650公开的调节序列、美国申请公开号2010/0233760号和W02010/107709公开的调节序列、或其他与编码异源多肽的分离的多核苷酸序列可操作地连接、在其转化的宿主细胞中有功能的调节序列。在一些实施方案中，编码异源多肽的核酸序列是为特定的微藻宿主细胞密码子优化的，以最大化翻译效率。本发明也涉及包含本发明的表达盒的重组载体。重组载体包括但不限于质粒、噬菌体和病毒。在一些实施方案中，重组载体是线性化载体。在一些实施方案中，重组载体是表达载体。本文所用的短语“表达载体”指适于生产编码产物(如感兴趣的蛋白)的载体。在一些实施方案中，将编码要生产的产物的核酸序列插入重组载体以产生重组核酸分子。将编码要产生的异源多肽的核酸序列以将该核酸序列与载体中的调节序列(如破囊壶菌目启动子)可操作地连接的方式插入载体，其使得所述核酸序列在重组微生物中能够转录和翻译。在一些实施方案中，选择标记，包括任何本文所述的选择标记，使得能够选择已将本发明的重组核酸分子成功引入的重组微生物。在一些实施方案中,本发明的宿主细胞产生的异源多肽以商业规模生产。商业规模包括从在规格彡100L、彡I, 000L、彡10, 000L或彡100, 000L的通气发酵罐中生长的微生物来产生异源多肽。在一些实施方案中，在带有搅拌的通气发酵罐中进行商业规模生产。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞产生的异源多肽可以积累在细胞内或可以 从细胞分泌，例如作为可溶性异源多肽分泌到培养基中。在一些实施方案中，本发明生产的异源多肽从细胞、从培养基、或细胞生长的发酵培养基中回收。在一些实施方案中，异源多肽是作为可溶性异源多肽回收自培养基的分泌的异源多肽。在一些实施方案中，异源多肽是包含信号肽的分泌的蛋白。在一些实施方案中，本发明生产的异源多肽包含指导其在内质网中滞留、指导其胞外分泌、或指导其到其他细胞器或细胞区室的定位信号。在一些实施方案中，异源多肽包含信号肽。在一些实施方案中，异源多肽包含Na/Pi_IIb2转运蛋白信号肽或Secl转运蛋白。在一些实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 37的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 37的氨基酸序列的信号肽的异源多肽分泌到培养基中。在一些实施方案中，在分泌过程中从蛋白切除信号肽，产生蛋白的成熟形式。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞产生的异源多肽是糖基化的。在一些实施方案中，本发明产生的异源多肽的糖基化模式比酵母或大肠杆菌中产生的蛋白更紧密类似于哺乳动物的糖基化模式。在一些实施方案中，本发明的微藻宿主细胞产生的异源多肽包含N-联糖基化模式。当糖基化模式与主题生物中发现的糖基化模式相似时，用于治疗目的的糖基化蛋白不太可能促进抗糖型的免疫应答。相反地，具有不符合主题生物特征的连接或糖的糖基化蛋白更可能是有抗原性的。也可以通过特定的糖型调节效应功能。例如，IgG可以调节促-或抗-炎反应，这与其在Fe区糖型上分别不存在或存在末端唾液酸相关(Kaneko 等，Science 313:670-3 (2006))。本发明进一步涉及一种生产重组异源多肽的方法，该方法包括在足够表达编码异源多肽的多核苷酸序列的条件下培养本发明的重组微藻宿主细胞。在一些实施方案中，重组异源多肽是从宿主细胞分泌的并从培养基中回收。在一些实施方案中，从细胞分泌的异源多肽包含分泌信号肽。根据用于生产的载体和宿主系统，本发明的重组异源多肽可以保留在重组细胞中，可以分泌到发酵培养基中，可以分泌到两层细胞膜之间的空间，或者可以保留在细胞膜的外表面。本文使用的短语“回收蛋白”指收集包含蛋白的发酵培养基而不需暗指额外的分离或纯化步骤。本发明的方法产生的异源多肽可以使用各种标准的蛋白纯化技术，例如但不限于，亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、刀豆蛋白A层析、层析聚焦和差相溶解。在一些实施方案中，本发明的方法产生的异源多肽以“基本上纯”的形式分离。如本文使用的“基本上纯”指允许有效使用异源多肽作为商业产品的纯度。在一些实施方案中，重组异源多肽在细胞内积累并从细胞回收。在一些实施方案中，本方法的宿主细胞是破囊壶菌。在一些实施方案中，本方法的宿主细胞是裂殖壶菌属或破囊壶菌属的。在一些实施方案中，重组异源多肽是治疗性蛋白、食品酶或工业酶。在一些实施方案中，重组微藻宿主细胞是裂殖壶菌属的且重组异源多肽是包含分泌信号序列的治疗性蛋白。在一些实施方案中，本发明的重组载体是靶向载体。本文使用的短语“靶向载体”指用于将特定核酸分子递送到重组细胞内的载体，其中该核酸分子被用来缺失或失活宿主细胞内的内源基因(即用于靶向基因破坏或敲除技术)。这种载体还被称作“敲除”载体。在一些实施方案中，靶向载体的一部分具有与宿主细胞中靶基因(即，靶向以缺失或失活的基因)的核酸序列同源的核酸序列。在一些实施方案中，插入载体的核酸分子(即插入序列)与靶基因是同源的。在一些实施方案中，载体插入序列的核酸序列被设计成与靶基因结合，使得靶基因和插入序列进行同源重组，藉此使内源靶基因缺失、失活或削弱(即， 通过突变或缺失内源靶基因的至少一部分)。分离的核酸分子根据本发明，分离的核酸分子是已自其天然环境移出的核酸分子(即，已经过人为操作)，其天然环境是该核酸分子在自然界中存在于其中的基因组或染色体。如此，“分离的”并不必然反映核酸分子已被纯化的程度，而是表示该分子不包括该核酸分子在自然界中存在于其中的整个基因组或整个染色体。分离的核酸分子可以包括DNA、RNA(例如mRNA)，或DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。虽然短语“核酸分子”主要指物理的核酸分子而短语“核酸序列”或“多核苷酸序列”主要指核酸分子中的核苷酸序列，但所述短语可以互换使用，尤其是涉及能够编码异源多肽的核酸分子、多核苷酸序列、或者核酸序列。在一些实施方案中，利用重组DNA技术(例如，聚合酶链式反应(PCR)扩增，克隆)或化学合成产生本发明的分离的核酸分子。分离的核酸分子包括天然的核酸分子及其同源物，包括但不限于，天然的等位基因变体和修饰的核酸分子，其中已经将核苷酸以如下方式插入、缺失、取代和/或倒置，该方式使得这样的修饰在所编码的异源多肽的序列、功能和/或生物活性上提供期望的效果。启动子序列、终止子序列、信号肽序列、或任何其他序列的核酸序列互补物指与具有启动子序列、终止子序列、信号指肽序列、或任何其他序列的链互补的核酸链的核酸序列。双链DNA最好包含单链DNA和其具有作为所述单链DNA互补物的序列的互补链。由此，核酸分子可以是双链或单链的，并包括那些与本发明的序列和/或本发明的序列的互补物，在“严紧”杂交条件下形成稳定杂交体的核酸分子。推断互补序列的方法是本领域熟练技术人员已知的。术语“多肽”包括单链多肽分子以及其中单独的组分多肽通过共价或非共价手段连接形成的多重多肽复合物。根据本发明，分离的多肽是已自其自然的环境移出的多肽(即，已经过人为操作)，并可以包括例如纯化的蛋白、纯化的肽、部分纯化的蛋白、部分纯化的肽、重组生产的蛋白或肽，和合成产生的蛋白或肽。[0093]如本文使用的，重组微生物具有使用重组技术由其正常(即野生型或天然发生的)形式修饰(即突变或改变)的基因组。根据本发明的重组微生物可以包括这样的微生物，其中以使一种或多种修饰在该微生物中提供所需效果的方式，在其中插入、缺失、或修饰了(即突变，例如，通过核苷酸的插入、缺失、取代和/或倒置)核酸分子。如本文使用的，导致基因表达、基因功能、或基因产物(即由基因编码的蛋白)的功能降低的遗传修饰，可称作基因的失活(全部或部分)、缺失、间断、阻断或下调。例如导致基因编码蛋白的功能降低的基因遗传修饰可以是下列造成的基因的完全缺失(即在重组微生物中不存在该基因，并因此重组微生物中不存在该蛋白)，基因突变导致蛋白翻译不完全或者不翻译(例如蛋白不表达)，基因突变降低或完全消除蛋白的天然功能(例如，表达的蛋白具有降低的活性或无活性(例如酶活或作用)。导致基因表达或功能增加的遗传修饰可称作基因的扩 增、过生产、过表达，活化、增强、添加或上调。启动子启动子是指导关联的编码区的转录的DNA区。在一些实施方案中，启动子来自网粘菌门的微生物。在一些实施方案中，启动子来自破囊壶菌，包括但不限于以SAM2179保藏的微生物(保藏者命名为“吾肯氏壶菌属SAM2179”)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)或破囊壶菌属或裂殖壶菌属的微生物。裂殖壶菌属包括但不限于 Schizochytrium aggregatum、Schizochytrium limacinum、裂殖壶菌属菌种(S31) (ATCC 20888)、裂殖壶菌属菌种(S8) (ATCC 20889)、裂殖壶菌属菌种(LC-RM) (ATCC18915)、裂殖壶菌属菌种(SR 21)、保藏的裂殖壶菌菌株ATCC 28209、和保藏的裂殖壶菌菌株 IFO 32693。启动子可以至少在破囊壶菌中具有启动子活性，并包括全长启动子序列及其功能片段、融合序列，和自然发生的启动子的同源物。启动子的同源物与自然发生的启动子区别在于至少一个、两个、三个或几个核苷酸已被缺失、插入、倒置、取代和/或衍生化。虽然活性可以增加、减少、或使其依赖于某些刺激，启动子的同源物至少在破囊壶菌中能够保留作为启动子的活性。启动子可以包含一个或多个赋予发育和组织特异性调节性调控或表达的序列元件。在一些实施方案中，本文所述的分...
【专利技术属性】
技术研发人员：ACV贝恩，JC利普梅尔，KE埃普特，RE泽克尔，
申请(专利权)人：DSMIP资产公司，
类型：
国别省市：
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