VEGF/DLL4结合剂及其应用制造技术

本发明专利技术涉及VEGF结合剂、DLL4结合剂、VEGF/DLL4双特异性结合剂以及利用所述结合剂治疗如癌症等疾病的方法。本发明专利技术提供了特异性结合人VEGF的抗体、特异性结合人DLL4的抗体以及特异性结合人VEGF和/或人DLL4的双特异性抗体。本发明专利技术还提供了利用所述试剂抑制肿瘤生长的方法。此外，还描述了癌症治疗方法，该方法包括对患有肿瘤或癌症的患者施用治疗有效量的本发明专利技术的试剂或抗体。

【技术实现步骤摘要】
VEGF/DLL4结合剂及其应用本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/US2012/056886，国际申请日为2012年09月24日，中国国家申请号为201280056471.3，进入中国国家阶段的进入日为2014年05月16日，专利技术名称为“VEGF/DLL4结合剂及其应用”。
本专利技术一般性涉及结合VEGF、DLL4或VEGF和DLL4两者的抗体和其它试剂，特别是抗VEGF/抗DLL4双特异性抗体，以及利用所述抗体或其它试剂来治疗如癌症等疾病的方法。
技术介绍
血管发生在包括实体瘤和肿瘤转移的许多病症的发病机理中起着重要作用。新的血管的产生对于为肿瘤的生长和扩散提供氧和养分至关重要，因而血管发生是癌治疗的好靶标。血管发生涉及充当血管发生活化剂的蛋白家族，包括血管内皮生长因子(VEGF-A)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-E以及它们各自的受体(VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3)。VEGF-A也称为VEGF或血管通透因子(VPF)，其以由单个VEGF基因的替代选择性mRNA剪接而产生的数种亚型存在，以VEGF165是最为生物相关的亚型。抗VEGF抗体在体外和体内已显示出对肿瘤细胞生长的抑制。已开发出人抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗(AVASTIN)，且其已在美国批准作为癌治疗剂。Notch信号传导途径是普遍保守的信号转导体系。其涉及包括胚胎模式形成和胚胎后组织维持在内的发育期间的细胞命运的决定。另外，Notch信号传导已被鉴定为造血干细胞的维持中的关键因素。Notch途径已与血液和实体肿瘤及癌联系起来。许多与肿瘤发生相关的细胞功能和微环境线索据显示会受Notch途径信号传导的调节，包括细胞增殖、凋亡、粘附和血管发生(Leong等，2006,Blood,107:2223-2233)。另外，Notch受体和/或Notch配体据显示在许多人类癌中起着潜在致癌性作用，所述癌包括急性髓系白血病、B细胞慢性淋巴性白血病、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、T细胞急性成淋巴细胞性白血病、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和皮肤癌(Leong等，2006,Blood,107:2223-2233)。δ样4配体(DLL4)是Notch途径的重要成分，且已被鉴定为癌治疗的靶标。DLL4是Notch配体，其特征是N端结构域、Delta/Serrate/Lag-2(DSL)结构域和胞外结构域内的串联EGF样重复片段。据报道，DLL4受VEGF诱导并且DLL4可以充当血管增生的负反馈调节剂。抗DLL4抗体据显示会增强血管新生萌发和支化，这会导致非生产性血管发生并减少肿瘤生长(Noguera-Troise等，2006,Nature,444:1032-1037)。另外，抗DLL4抗体21M18据显示会抑制肿瘤生长并降低异种移植肿瘤模型中的癌干细胞频率(Hoey等，2009,CellStemCell,5:168-177；美国专利7,750,124号)。虽然在用于癌治疗的单克隆抗体的开发方面已经取得显著进展，然而对于进一步的改进仍然有巨大的潜力。一类具有提高的效能和/或降低的副作用(例如，毒性)的前景的抗体分子是双特异性抗体。早期双特异性抗体主要利用两种抗体的化学交联产生，或为杂合杂交瘤或“四源杂交瘤(quadroma)”。四源杂交瘤的一个成功形式是Triomabs，其为小鼠/大鼠组合，展示出优先物种特异性重链/轻链配对。更近期以来，抗体工程化的发展已提供了多种多样的新抗体形式，包括但不限于串联scFv(bi-scFv)、双功能抗体、串联双功能抗体(四功能抗体)、单链双功能抗体和双可变区抗体。本专利技术的目标之一在于提供用于癌治疗的改进分子，特别是特异性结合人VEGF和人DLL4的双特异性抗体。
技术实现思路
本专利技术提供了结合VEGF和/或DLL4的如抗体等结合剂(VEGF/DLL4结合剂)，以及包含所述结合剂的组合物，如药物组合物。还提供了结合VEGF或DLL4以及至少一种另外的抗原或靶标的结合剂以及此类结合剂的药物组合物。在某些实施方式中，结合剂是新型多肽，例如抗体、抗体片段和与此类抗体相关的其它多肽。在某些实施方式中，结合剂是特异性结合人VEGF的抗体。在一些实施方式中，结合剂是特异性结合人DLL4的抗体。在一些实施方式中，结合剂是特异性结合人VEGF和人DLL4的双特异性抗体。本专利技术还提供了通过对具有肿瘤的受试对象施用所述结合剂来抑制肿瘤生长的方法。本专利技术还提供了通过对有需要的受试对象施用所述结合剂来治疗癌的方法。在一些实施方式中，治疗癌或抑制肿瘤生长的方法包括用所述结合剂靶向癌干细胞。在某些实施方式中，所述方法包括减少肿瘤中癌干细胞的频率、减少肿瘤中癌干细胞的数目、降低肿瘤的致瘤性和/或通过减少肿瘤中癌干细胞的数目或频率来降低肿瘤的致瘤性。在一方面，本专利技术提供了特异性结合人VEGF的结合剂，如抗体。在一些实施方式中，所述结合剂抑制VEGF与至少一种VEGF受体的结合。在一些实施方式中，所述结合剂抑制VEGF与VEGFR-1和/或VEGFR-2的结合。在一些实施方式中，所述结合剂调节血管发生。在某些实施方式中，抗体或其它结合剂除人VEGF外还特异性结合和/或抑制人DLL4。在一些实施方式中，结合剂是抗体，该抗体包含：包含NYWMH(SEQIDNO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQIDNO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY(SEQIDNO:19)的重链CDR3；以及包含RASESVDNYGISFMK(SEQIDNO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQIDNO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQIDNO:22)的轻链CDR3。在某些实施方式中，结合剂是抗体，该抗体包含：与SEQIDNO:11具有至少80％序列同一性的重链可变区；和/或与SEQIDNO:12具有至少80％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，结合剂包含：与SEQIDNO:11具有至少90％序列同一性的重链可变区；和/或与SEQIDNO:12具有至少90％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，结合剂包含：与SEQIDNO:11具有至少95％序列同一性的重链可变区；和/或与SEQIDNO:12具有至少95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，结合剂是一种抗体，该抗体包含：SEQIDNO:11的重链可变区；和/或SEQIDNO:12的轻链可变区。在一些实施方式中，结合剂是抗体219R45、219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R79、219R45-MB-21R75或219R45-MB-21R83。在另一方面，本专利技术提供了特异性结合人DLL4的结合剂，如抗体。在一些实施方式中，所述结合剂抑制DLL4与至少一种Notch受体的结合。在一些实施方式中，所述结合剂抑制DLL4与Notch1、Notch2、Notch3和/或Notch4的结合。在一些实施方式中，所述结合剂抑制Notch信号传导。在一些实施方式中，所述结合剂促进非生产性血管发生(unproductiveangiogenesis)。在某些实施方式中，所述抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)的分离抗体，所述抗体包含：(a)包含NYWMH(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO:19)的重链CDR3；和(b)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。

【技术特征摘要】
2011.09.23 US 61/538,454;2012.02.10 US 61/597,409;1.一种特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)的分离抗体，所述抗体包含：(a)包含NYWMH(SEQIDNO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQIDNO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY(SEQIDNO:19)的重链CDR3；和(b)包含RASESVDNYGISFMK(SEQIDNO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQIDNO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQIDNO:22)的轻链CDR3。2.一种特异性结合人VEGF的分离抗体，所述抗体包含：(a)与SEQIDNO:11具有至少90％序列同一性的重链可变区；和(b)与SEQIDNO:12具有至少90％序列同一性的轻链可变区。3.如权利要求2所述的抗体，所述抗体包含：(a)与SEQIDNO:11具有至少95％序列同一性的重链可变区；和(b)与SEQIDNO:12具有至少95％序列同一性的轻链可变区。4.如权利要求2所述的抗体，所述抗体包含：(a)包含SEQIDNO:11的重链可变区；和(b)包含SEQIDNO:12的轻链可变区。5.如权利要求2所述的抗体，所述抗体包含：(a)基本由SEQIDNO:11组成的重链可变区；和(b)基本由SEQIDNO:12组成的轻链可变区。6.一种特异性结合人VEGF的分离抗体，所述抗体包含：(a)基本由SEQIDNO:49或SEQIDNO:7组成的重链；和(b)基本由SEQIDNO:8组成的轻链。7.如权利要求1至6中任一项所述的抗体，所述抗体抑制VEGF与至少一种VEGF受体的结合。8.如权利要求7所述的抗体，其中，所述VEGF受体是VEGFR-1或VEGFR-2。9.如权利要求1至8中任一项所述的抗体，所述抗体调节血管发生。10.一种特异性结合人δ样配体4(DLL4)的分离抗体，所述抗体包含：(a)包含TAYYIH(SEQIDNO:13)的重链CDR1、包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQIDNO:14)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQIDNO:16)的重链CDR3；和(b)包含RASESVDNYGISFMK(SEQIDNO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQIDNO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQIDNO:22)的轻链CDR3。11.一种特异性结合人δ样配体4(DLL4)的分离抗体，所述抗体包含：(a)包含TAYYIH(SEQIDNO:13)的重链CDR1、包含YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQIDNO:59)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQIDNO:16)的重链CDR3；和(b)包含RASESVDNYGISFMK(SEQIDNO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQIDNO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQIDNO:22)的轻链CDR3。12.一种特异性结合人δ样配体4(DLL4)的分离抗体，所述抗体包含：(a)包含TAYYIH(SEQIDNO:13)的重链CDR1、包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQIDNO:65)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQIDNO:16)的重链CDR3；和(b)包含RASESVDNYGISFMK(SEQIDNO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQIDNO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQIDNO:22)的轻链CDR3。13.一种特异性结合人DLL4的分离抗体，所述抗体包含：(a)包含SEQIDNO:10、SEQIDNO:58或SEQIDNO:64的重链可变区；和(b)包含SEQIDNO:12的轻链可变区。14.一种特异性结合人DLL4的分离抗体，所述抗体包含：(a)基本由SEQIDNO:10、SEQIDNO:58或SEQIDNO:64组成的重链可变区；和(b)基本由SEQIDNO:12组成的轻链可变区。15.一种特异性结合人DLL4的分离抗体，所述抗体包含：(a)基本由SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:48、SEQIDNO:56或SEQIDNO:62组成的重链；和(b)基本由SEQIDNO:8组成的轻链。16.如权利要求10至15中任一项所述的抗体，所述抗体抑制DLL4与至少一种Notch受体的结合。17.如权利要求16所述的抗体，其中，所述Notch受体选自由Notch1、Notch2、Notch3和Notch4组成的组。18.如权利要求10至17中任一项所述的抗体，所述抗体抑制Notch信号传导。19.如权利要求10至18中任一项所述的抗体，所述抗体为单克隆抗体。20.如权利要求10至19中任一项所述的抗体，所述抗体为重组抗体。21.如权利要求1至20中任一项所述的抗体，所述抗体为嵌合抗体。22.如权利要求1至21中任一项所述的抗体，所述抗体为人源化抗体。23.如权利要求1至19中任一项所述的抗体，所述抗体为人抗体。24.如权利要求1至23中任一项所述的抗体，所述抗体为双特异性抗体。25.如权利要求1至24中任一项所述的抗体，所述抗体为IgG1抗体。26.如权利要求1至24中任一项所述的抗体，所述抗体为IgG2抗体。27.如权利要求1至24中任一项所述的抗体，所述抗体为包含抗原结合位点的抗体片段。28.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：a)特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点；和b)特异性结合人DLL4的第二抗原结合位点，其中，所述第一抗原结合位点包含：包含NYWMH(SEQIDNO:17)的重链CDR1、包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQIDNO:18)的重链CDR2和包含HYDDKYYPLMDY(SEQIDNO:19)的重链CDR3；其中，所述第二抗原结合位点包含：包含TAYYIH(SEQIDNO:13)的重链CDR1、包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQIDNO:14)、YISSYNGATNYNQKFKG(SEQIDNO:15)、YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQIDNO:59)或YISNYNRATNYNQKFKG(SEQIDNO:65)的重链CDR2和包含RDYDYDVGMDY(SEQIDNO:16)的重链CDR3；并且其中，所述第一抗原结合位点和第二抗原结合位点均包含：包含RASESVDNYGISFMK(SEQIDNO:20)的轻链CDR1、包含AASNQGS(SEQIDNO:21)的轻链CDR2和包含QQSKEVPWTFGG(SEQIDNO:22)的轻链CDR3。29.如权利要求28所述的双特异性抗体，其中，所述第二抗原结合位点包含：包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQIDNO:14)的重链CDR2。30.如权利要求28所述的双特异性抗体，其中，所述第二抗原结合位点包含：包含YISSYNGATNYNQKFKG(SEQIDNO:15)的重链CDR2。31.如权利要求28所述的双特异性抗体，其中，所述第二抗原结合位点包含：包含YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQIDNO:59)的重链CDR2。32.如权利要求28所述的双特异性抗体，其中，所述第二抗原结合位点包含：包含YISNYNGATNYNQKFKG(SEQIDNO:65)的重链CDR2。33.一种特异性结合人VEGF和人DLL4的双特异性抗体，所述抗体包含：(a)与SEQIDNO:11具有至少90％序列同一性的第一重链可变区；(b)与SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:58或SEQIDNO:64具有至少90％序列同一性的第二重链可变区；和(c)与SEQIDNO:12具有至少90％序列同一性的第一轻链可变区和第二轻链可变区。34.如权利要求33所述的双特异性抗体，其中(a)所述第一重链可变区与SEQIDNO:11具有至少95％的序列同一性；(b)所述第二重链可变区与SEQIDNO:9具有至少95％的序列同一性；和(c)所述第一轻链可变区和所述第二轻链可变区与SEQIDNO:12具有至少95％的序列同一性。35.如权利要求33所述的双特异性抗体，其中(a)所述第一重链可变区与SEQIDNO:11具有至少95％的序列同一性；(b)所述第二重链可变区与SEQIDNO:10具有至少95％的序列同一性；和(c)所述第一轻链可变区和所述第二轻链可变区与SEQIDNO:12具有至少95％的序列同一性。36.如权利要求33所述的双特异性抗体，其中(a)所述第一重链可变区与SEQIDNO:11具有至少95％的序列同一性；(b)所述第二重链可变区与SEQIDNO:58具有至少95％的序列同一性；和(c)所述第一轻链可变区和所述第二轻链可变区与SEQIDNO:12具有至少95％的序列同一性。37.如权利要求33所述的双特异性抗体，其中(a)所述第一重链可变区与SEQIDNO:11具有至少95％的序列同一性；(b)所述第二重链可变区与SEQIDNO:64具有至少95％的序列同一性；和(c)所述第一轻链可变区和所述第二轻链可变区与SEQIDNO:12具有至少95％的序列同一性。38.如权利要求33所述的双特异性抗体，其中(a)所述第一重链可变区基本由SEQIDNO:11组成；(b)所述第二重链可变区基本由SEQIDNO:9组成；且(c)所述第一轻链可变区和所述第二轻链可变区基本由SEQIDNO:12组成。39.如权利要求33所述的双特异性抗体，其中(a)所述第一重链可变区基本由SEQIDNO:11组成；(b)所述第二重链可变区基本由SEQIDNO:10组成；且(c)所述第一轻链可变区和所述第二轻链可变区基本由SEQIDNO:12组成。40.如权利要求33所述的双特异性抗体，其中(a)所述第一重链可变区基本由SEQIDNO:11组成；(b)所述第二重链可变区基本由SEQIDNO:58组成；且(c)所述第一轻链可变区和所述第二轻链可变区基本由SEQIDNO:12组成。41.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：奥斯丁·L·格尼，阿龙·肯·萨拓，C·J·邦德，
申请(专利权)人：昂考梅德药品有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US