RSPO结合剂和其应用制造技术

本发明专利技术涉及RSPO结合剂和应用，特别涉及RSPO结合剂和使用该结合剂治疗诸如癌等疾病的方法。本发明专利技术还提供特异性结合人RSPO蛋白并调节β连环素活性的抗体。本发明专利技术还提供使用调节RSPO蛋白的活性的试剂的方法，所述试剂例如为特异性结合RSPO1、RSPO2和/或RSPO3并抑制肿瘤生长的抗体。还描述了治疗癌的方法，所述方法包括对具有肿瘤或癌的患者施用治疗有效量的本发明专利技术的试剂或抗体。

【技术实现步骤摘要】
本申请是是分案申请，其原申请的国际申请号是PCT/US2012/046746，国际申请日是2012年7月13日，中国国家申请号为201280045135.9，进入中国的日期为2014年3月14日，专利技术名称为“RSPO结合剂和其应用”。
本专利技术的领域大体上涉及结合包括RSPO1、RSPO2和RSPO3在内的R-反应蛋白(RSPO)(特别是人R-反应蛋白)的抗体和其他试剂，以及使用所述抗体或其他试剂来治疗诸如癌等疾病的方法。
技术介绍
蛋白质的R-反应蛋白(RSPO)家族在脊椎动物中是保守的，并且包括四个成员，RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4。这些蛋白被以各种名称相称，包括顶板特异性反应蛋白、hPWTSR(hRSPO3)、THS2D(RSPO3)、Cristin 1-4和Futrin 1-4。RSPO是小的分泌蛋白，其共享约40％至60％的序列同源性和结构域组织。所有的RSPO蛋白在N-末端含有两个弗林蛋白酶(furin)样富半胱氨酸结构域，其连着血小板反应蛋白结构域以及碱性带电C末端尾部(Kim等，2006,Cell Cycle,5:23-26)。研究已经显示，RSPO蛋白在脊椎动物发育(Kamata等,2004,Biochim.BiophysActa,1676:51-62)期间和在非洲爪蟾肌发生(Kazanskaya等,2004,Dev.Cell,7:525-534)中起作用。RSPO1还据显示充当胃肠上皮细胞用的强效丝裂原(Kim等,2005,Science,309:1256-1259)。已知RSPO蛋白激活与Wnt信号传导相似的β连环素信号传导，但是仍正在研究RSPO蛋白和Wnt信号传导之间的关系。已经报道RSPO蛋白对Wnt配体拥有正向调节活性(Nam等,2006,JBC 281:13247-57)。该研究报道了RSPO蛋白能够充当Frizzled8和LRP6受体配体，并诱导β连环素信号传导(Nam等,2006,JBC 281:13247-57)。近期研究已经鉴定了RSPO蛋白和诸如LGR5等LGR(富含亮氨酸重复的G蛋白偶联受体)蛋白之间的相互作用(美国专利公开第2009/0074782和2009/0191205号)，这些数据提出了β-连环素信号传导的激活的替代途径。Wnt信号传导途径已被鉴定为癌治疗的潜在靶标。Wnt信号传导途径是胚胎模式形成、胚胎后组织维持和干细胞生物学的数种关键调节因素之一。更具体而言，Wnt信号传导在细胞极性的产生和细胞命运特化(包括干细胞群的自我更新)中起重要作用。不受调节的Wnt途径的激活与许多人类癌症有关，据信在所述癌症中这样的激活能够改变细胞的发育命运。Wnt途径的激活可以将肿瘤细胞保持在未分化状态和/或导致不受控的增殖。因此癌变可以通过压制控制正常发育和组织修复的体内平衡机制进行(在Reya&Clevers,2005,Nature,434:843-50；Beachy等,2004,Nature,432:324-31中综述)。Wnt信号传导途径首次在果蝇发育突变无翼体(wg)中阐明，并且来自鼠类原癌基因int-1(现在的Wnt1)(Nusse&Varmus,1982,Cell,31:99-109；Van Ooyen&Nusse,1984,Cell,39:233-40；Cabrera等,1987,Cell,50:659-63；Rijsewijk等,1987,Cell,50:649-57)。Wnt基因编码分泌的脂修饰的糖蛋白，所述糖蛋白在哺乳动物中已被鉴定出其中的19个。这些分泌的配体激活由Frizzled(FZD)受体家族成员和低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5或6(LRP5/6)组成的受体复合物。FZD受体是G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的7个跨膜结构域蛋白，并且含有具有10个保守性半胱氨酸的大的细胞外N末端配体结合结构域，该结构域被称为富半胱氨酸结构域(CRD)或Fri结构域。存在10种人FZD受体，FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9和FZD10。不同的FZD CRD对特定的Wnt蛋白具有不同的结合亲和性(Wu&Nusse,2002,J.Biol.Chem.,277:41762-9)，因此将FZD受体分类为激活典型β连环素途径的受体和激活非典型途径的受体(Miller等,1999,Oncogene,18:7860-72)。在经附近注射鼠类病毒而转化的乳腺瘤中将Wnt1(最初称为int1)鉴定为致癌基因后，首次揭示了Wnt信号传导在癌中的作用(Nusse&Varmus,1982,Cell,31:99-109)。近期还已经积累了Wnt信号传导在乳腺癌中的作用的额外证据。例如，乳腺中β-连环素的转基因过表达导致增生和腺癌(Imbert等,2001,J.Cell Biol.,153:555-68；Michaelson&Leder,2001,Oncogene,20:5093-9)，而Wnt信号传导的丧失干扰正常的乳腺发育(Tepera等,2003,J.Cell Sci.,116:1137-49；Hatsell等,2003,J.Mammary Gland Biol.Neoplasia,8:145-58)。在人乳腺癌中，β-连环素累积在超过50％的癌中涉及激活的Wnt信号传导，虽然尚未鉴定出具体的突变，但是观察到Frizzled 受体表达的上调(Brennan&Brown,2004,J.Mammary Gland Biol.Neoplasia,9:119-31；Malovanovic等,2004,Int.J.Oncol.,25:1337-42)。Wnt途径的激活还与结直肠癌相关。所有结直肠癌中的约5％至10％遗传有作为家族性腺瘤性息肉病(FAP)的主要形式之一，该疾病是一种常染色体显性疾病，其中约80％的受影响个体含有腺瘤性结肠息肉病(APC)基因中的种系突变。还在包括Axin和β-连环素在内的其他Wnt途径组分中鉴定出突变。个体的腺瘤是含有第二失活等位基因的上皮细胞的克隆外生长物，大量的FAP腺瘤必然通过致癌基因和/或肿瘤抑制基因的另外突变导致腺癌的发展。此外，Wnt信号传导途径的激活，包括APC中的功能丧失突变和β-连环素中的稳定化突变，能够诱导小鼠模型中的增生性发育和肿瘤生长(Oshima等,1997,Cancer Res.,57:1644-9；Harada等,1999,EMBO J.,18:5931-42)。与乳腺癌和结肠癌相似，黑素瘤经常具有Wnt途径的组成性激活，这可以通过β-连环素的细胞核累积表明。将Wnt/β-连环素途径在一些黑素瘤和细胞系中的激活归因于诸如APC、ICAT、LEF1和β-连环素等途径组分的修饰(例如参见Larue等，2006,Frontiers Biosci.,11:733-742)。但是，关于Wnt/β-连环素信号传导在黑素瘤中的确切作用在文献中存在矛盾的报道。例如，一个研究从黑素瘤发现细胞核β-连环素的水平升高与存活率提高相关，并且发现激活的Wnt/β-连环素信号传导与细胞增本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性结合人R‑反应蛋白1(RSPO1)的分离的抗体，所述分离的抗体包含：(a)包含TGYTMH(SEQ ID NO:12)的重链CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO:13)的重链CDR2和包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO:14)的重链CDR3；和/或(b)包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:15)的轻链CDR1，包含WASTRHT(SEQ ID NO:16)的轻链CDR2和包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:17)的轻链CDR3。

【技术特征摘要】
2011.07.15 US 61/508,403;2011.08.09 US 61/521,547;1.一种特异性结合人R-反应蛋白1(RSPO1)的分离的抗体，所述分离的抗体包含：(a)包含TGYTMH(SEQ ID NO:12)的重链CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO:13)的重链CDR2和包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO:14)的重链CDR3；和/或(b)包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:15)的轻链CDR1，包含WASTRHT(SEQ ID NO:16)的轻链CDR2和包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:17)的轻链CDR3。2.一种特异性结合人RSPO1的分离的抗体，所述分离的抗体包含：(a)与SEQ ID NO:10具有至少90％序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的轻链可变区。3.如权利要求2所述的抗体，所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:10具有至少95％序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO:11具有至少95％序列同一性的轻链可变区。4.如权利要求2所述的抗体，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:10的重链可变区；和/或(b)包含SEQ ID NO:11的轻链可变区。5.如权利要求2所述的抗体，所述抗体包含：(a)基本上由SEQ ID NO:10组成的重链可变区；和(b)基本上由SEQ ID NO:11组成的轻链可变区。6.一种特异性结合人RSPO1的分离的抗体，所述分离的抗体包含：(a)与SEQ ID NO:55具有至少90％序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO:59具有至少90％序列同一性的轻链可变区。7.如权利要求6所述的抗体，所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:55具有至少95％序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO:59具有至少95％序列同一性的轻链可变区。8.如权利要求6所述的抗体，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:55的重链可变区；和/或(b)包含SEQ ID NO:59的轻链可变区。9.如权利要求6所述的抗体，所述抗体包含：(a)基本上由SEQ ID NO:55组成的重链可变区；和(b)基本上由SEQ ID NO:59组成的轻链可变区。10.一种分离的抗体，所述分离的抗体与权利要求1～9中任一项所述的抗体竞争与RSPO1的特异性结合。11.一种分离的抗体，所述分离的抗体与权利要求1～10中任一项所述的抗体所结合的RSPO1上的表位相同。12.一种分离的抗体，所述分离的抗体所结合的RSPO1上的表位与权利要求1～10中任一项所述的抗体所结合的RSPO1上的表位重叠。13.如权利要求1～12中任一项所述的抗体，所述抗体是重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。14.如权利要求1～13中任一项所述的抗体，所述抗体是人源化抗体。15.如权利要求1～13中任一项所述的抗体，所述抗体是人抗体。16.如权利要求1～14中任一项所述的抗体，所述抗体是IgG1抗体或IgG2抗体。17.如权利要求1～14中任一项所述的抗体，所述抗体是包含抗原结合位点的抗体片段。18.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由ATCC保藏号为PTA-11970的杂交瘤细胞系生产。19.权利要求18所述的抗体的人源化形式。20.如权利要求1～19中任一项所述的抗体，所述抗体抑制RSPO1与至少一种富含亮氨酸重复的G蛋白偶联受体(LGR)的结合。21.如权利要求20所述的抗体，其中，所述LGR选自由LGR4、LGR5和LGR6组成的组。22.如权利要求21所述的抗体，其中，所述LGR是LGR5。23.如权利要求1～22中任一项所述的抗体，所述抗体抑制RSPO1信号传导。24.如权利要求1～23中任一项所述的抗体，所述抗体抑制β-连环素的激活。25.如权利要求1～24中任一项所述的抗体，所述抗体抑制β-连环素信号传导。26.如权利要求1～25中任一项所述的抗体，所述抗体抑制肿瘤生长。27.如权利要求1～26中任一项所述的抗体，所述抗体诱导肿瘤中分化标记物的表达。28.如权利要求1～27中任一项所述的抗体，所述抗体诱导肿瘤中的细胞进行分化。29.如权利要求1～28中任一项所述的抗体，所述抗体减小肿瘤中的癌干细胞的频率。30.一种多肽，所述多肽包含选自由以下序列组成的组中的序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69。31.如权利要求30所述的多肽，所述多肽是抗体。32.一种细胞，所述细胞包含或产生权利要求1～31中任一项所述的抗体或多肽。33.一种杂交瘤细胞系，所述细胞系具有ATCC保藏号PTA-11970。34.一种分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含编码权利要求1～31中任一项所述的抗体或多肽的多核苷酸。35.一种分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含选自由以下序列组成的组中的多核苷酸序列：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:58。36.一种载体，所述载体包含权利要求34或权利要求35所述的多核苷酸。37.一种细胞，所述细胞包含权利要求34或权利要求35所述的多核苷酸或者权利要求36所述的载体。38.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1～31中任一项所述的抗体或多肽和药学上可接受的载剂。39.一种抑制肿瘤生长的方法，其中，所述方法包括使所述肿瘤与有效量的权利要求1～29中任一项所述的抗体接触。40.一种抑制受试对象中肿瘤生长的方法，其中，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1～29中任一项所述的抗体。41.一种诱导受试对象中肿瘤细胞的分化的方法，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1～29中任一项所述的抗体。42.一种减小受试对象的肿瘤中的癌干细胞的频率的方法，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1～29中任一项所述的抗体。43.一种抑制细胞中β连环素信号传导的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的权利要求1～29中任一项所述的抗体接触。44.如权利要求43所述的方法，其中，所述细胞是肿瘤细胞。45.如权利要求39～42或44中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤选自由以下肿瘤组成的组：结直肠瘤、卵巢瘤、胰腺瘤、肺瘤、肝瘤、乳腺瘤、肾瘤、前列腺瘤、胃肠瘤、黑素瘤、子宫颈瘤、膀胱瘤、成胶质细胞瘤以及头颈瘤。46.如权利要求45所述的方法，其中，所述肿瘤是胰腺瘤。47.如权利要求45所述的方法，其中，所述肿瘤是卵巢瘤。48.一种治疗受试对象中的癌的方法，其中，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1～29中任一项所述的抗体。49.如权利要求48所述的方法，其中，所述癌选自由以下癌组成的组：结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤以及头颈癌。50.如权利要求49所述的方法，其中，所述癌是结直肠癌或胰腺癌。51.如权利要求50所述的方法，其中，所述结直肠癌包含腺瘤性结肠息肉病(APC)基因中的失活突变。52.如权利要求50所述的方法，其中，所述结直肠癌不包含APC基因中的失活突变。53.如权利要求50所述的方法，其中，所述结直肠癌包含野生型APC基因。54.如权利要求50所述的方法，其中，所述结直肠癌不包含β连环素基因中的失活突变。55.如权利要求49所述的方法，其中，所述癌是卵巢癌。56.如权利要求39～42或44～55中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤或所述癌表达的RSPO1水平比正常组织中的RSPO1水平高。57.如权利要求40～42或45～56中任一项所述的方法，其中，所述受试对象的肿瘤或癌已被去除。58.如权利要求39～42或44～57中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述肿瘤或癌中RSPO1的表达水平的步骤。59.如权利要求39～42或44～58中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述肿瘤或癌是否具有所述APC基因中的失活突变的步骤。60.如权利要求39～42或44～59中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述肿瘤或癌是否具有β连环素基因的激活突变的步骤。61.如权利要求58所述的方法，其中，所述确定RSPO1的表达水平的步骤在用所述抗体进行治疗或与所述抗体接触之前完成。62.如权利要求61所述的方法，其中，如果所述肿瘤或癌具有升高的RSPO1表达水平，则将所述抗体：(a)施用至所述受试对象；或(b)与所述肿瘤或肿瘤细胞接触。63.一种治疗受试对象中的疾病的方法，其中，所述疾病与β连环素的激活相关，所述方法包括施用治疗有效量的权利要求1～29中任一项所述的抗体。64.如权利要求39～63中任一项所述的方法，所述方法还包括施用至少一种另外的治疗剂。65.如权利要求64所述的方法，其中，所述另外的治疗剂是化学治疗剂。66.如权利要求64所述的方法，其中，所述另外的治疗剂是血管生成抑制剂。67.如权利要求39～42或45～66中任一项所述的方法，其中，所述受试对象是人。68.一种选择人受试对象以用结合RSPO1的抗体进行治疗的方法，所述方法包括：确定所述受试对象是否具有RSPO1表达水平升高的肿瘤，其中，如果所述肿瘤具有升高的RSPO1表达水平，则选择所述受试对象以用特异性结合RSPO1的抗体进行治疗。69.如权利要求68所述的方法，其中，所述肿瘤是卵巢瘤。70.如权利要求58、68或69中任一项所述的方法，其中，通过基于PCR的检验、微阵列分析或核苷酸测序来确定样品中RSPO1的表达水平。71.一种选择人受试对象以用结合RSPO1的抗体进行治疗的方法，所述方法包括：确定所述受试对象是否具有包含APC基因中的失活突变的肿瘤，其中，如果所述肿瘤具有所述APC基因中的失活突变，则选择所述受试对象以用特异性结合RSPO1的抗体进行治疗。72.如权利要求71所述的方法，其中，所述肿瘤是结直肠瘤。73.如权利要求59、71或72中任一项所述的方法，其中，通过基于PCR的检验、杂交检验、微阵列分析或核苷酸测序来确定样品中APC基因的失活突变。74.如权利要求70或73中任一项所述的方法，其中，所述样品是新鲜的肿瘤样品、冷冻的肿瘤样品或福尔马林固定的石蜡包埋样品。75.如权利要求68～74中任一项所述的方法，其中，所述抗体是权利要求1～29中任一项所述的抗体。76.一种分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合人R-反应蛋白2(RSPO2)，并且包含：(a)包含SSYAMS(SEQ ID NO:29)的重链CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:30)的重链CDR2和包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO:31)的重链CDR3；和/或(b)包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO:32)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:33)的轻链CDR2和包含QQHYSTP(SEQ ID NO:34)的轻链CDR3。77.一种分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合人RSPO2，并且包含：(a)与SEQ ID NO:27具有至少90％序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO:28具有至少90％序列同一性的轻链可变区。78.如权利要求77所述的抗体，所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:27具有至少95％序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO:28具有至少95％序列同一性的轻链可变区。79.如权利要求77所述的抗体，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:27的重链可变区；和/或(b)包含SEQ ID NO:28的轻链可变区。80.如权利要求77所述的抗体，所述抗体包含：(a)基本上由SEQ ID NO:27组成的重链可变区；和(b)基本上由SEQ ID NO:28组成的轻链可变区。81.一种分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合人RSPO2，并且包含：(a)与SEQ ID NO:63具有至少90％序...

【专利技术属性】
技术研发人员：奥斯丁·L·格尼，富米考·塔卡达·阿克塞尔罗德，蒂莫西·查尔斯·霍伊，C·沙尔捷库尔托，
申请(专利权)人：昂考梅德药品有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US