本发明专利技术公开了一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。本发明专利技术还公开了上述全人源抗GPC3的全分子IgG抗体的应用。本发明专利技术还公开了一种编码上述全人源抗GPC3的全分子IgG抗体的基因。本发明专利技术还公开了一种表达载体，包含有上述基因以及与该基因操作性相连的表达调控序列。本发明专利技术还公开了一种宿主细胞，被上述表达载体所转化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物免疫
，尤其涉及一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体及其应用，还涉及其编码基因，其编码基因的表达载体，及宿主细胞。
技术介绍
原发性肝细胞癌(HCC)的发病率在恶性肿瘤中排名世界第5位，而死亡率则位居第3位。我国是肝癌高发区之一，每年有超过10万人死于原发性肝癌，只有10-20％的HCC患者能在早期被诊断且接受手术治疗，大部分患者被诊断时已是晚期，预后较差，且治疗手段不多。此外，原发性肝癌容易发生转移，即使是小肝癌根治性切除，术后5年转移复发率仍高达50％。HCC多通过血液循环，其次为淋巴管，也可以直接蔓延、侵袭或种植。肝癌的肝外器官血行转移发生较早且交广泛，有研究表明，在尸检中发现60％以上的肝细胞癌伴肝外转移，其中以肺最为常见(约占血行转移中的90％)。因此，早期诊治是改善HCC患者预后的最关键因素之一。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖中的磷脂酰肌醇聚糖家族通过共价键(glycosylphosphatilinositol，GPI)锚定在细胞表面的。在脊椎动物中，6个家庭成员已确定(GPCl-6)。磷脂酰肌醇聚糖蛋白能够修改细胞信号通路，导致细胞增殖和组织生长。磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)在肝细胞癌和其癌症包括黑色素瘤、鳞状细胞癌的肺，和卵巢透明细胞癌中高表达，而在正常组织中不表达。GPC3基因编码一个70kDa大小的前体核心蛋白，可以通过弗林蛋白酶裂解生成40kDa氨基(N)终端碎片和30kDa膜结合羧基(C)终端片段。其C端有两个硫酸肝素(HS)多糖链。GPC3蛋白通过GPI锚定在细胞膜表面。GPC3结合Wnt和Hedgehog信号通路中的蛋白，也可以结合一些基础的生长因子，如通过HS多糖链结合纤维母细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2)。抗GPC3抗体通过抑制GPC3基因功能可以阻止肝癌细胞的增殖或转移。目前抗GPC3抗体大多以杂交瘤方式制备得到，如申请号为201210086009.X的专利《GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株7D11及其制备方法和应用》，但往往特异性及亲和力不够理想。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体。本专利技术的目的又在于提供一种编码上述全人源抗GPC3的全分子IgG抗体的基因。本专利技术的目的又在于提供一种含有能编码上述全人源抗GPC3的全分子IgG抗体基因的表达载体。本专利技术的目的又在于提供一种被上述表达载体所转化的宿主细胞。本专利技术的目的还在于提供上述全人源抗GPC3的全分子IgG抗体的应用。为实现上述目的，本专利技术提出的一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。优选地，所述轻链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述重链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。本专利技术还提出的一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。本专利技术还提出的一种DNA分子，其编码上述全分子IgG抗体的轻链和/或重链。优选地，编码上述全分子IgG抗体的轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。优选地，编码如上述全分子IgG抗体的重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。本专利技术还提出的一种表达载体，包含有上述DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。本专利技术还提出的一种宿主细胞，被上述表达载体所转化。优选地，所述宿主细胞可以是被上述表达载体转化的293Freestyle细胞。本专利技术还提出的一种上述全分子IgG抗体在制备与GPC3相关的肿瘤的诊断或治疗药剂中的应用。本专利技术还提出的一种抑制GPC3介导的肿瘤药物，所述药物的活性成分为上述全分子IgG抗体。本专利技术使用噬菌体抗体库技术筛选到了对GPC3具有高度亲和力的人源Fab抗体，并获取了赋予所述抗体优异特性的重链和轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，并将所述抗体的重链和轻链可变区与含有抗体恒定区的表达载体连接，最终获得了具有特异的抗原结合性和在细胞学上证明抗体可以抑制肿瘤细胞的生长对肿瘤细胞有杀伤作用的全人源全分子抗体。与国内现有的抗GPC3鼠源单抗相比，本专利技术制备的是全人源IgG抗体，而且实验证明有很好的特异性及对GPC3阳性的肿瘤细胞有很好的杀伤作用。本专利技术提供了一种具有高特异性、良好亲和力的抗GPC3的全分子全人源单克隆抗体。GPC3在肝细胞癌和其癌症包括黑色素瘤、肺部鳞状细胞癌和卵巢透明细胞癌中高表达，而在正常组织中不表达，因此本专利技术的抗GPC3抗体可应用于有关GPC3阳性的肿瘤的诊断、治疗。本专利技术以GPC3为靶分子，在噬菌体抗体库技术的基础上制备出全分子人源抗体。对制备的人源抗GPC3抗体做功能鉴定，显示该抗体能够与GPC3特异性结合，体外GPC3阳性肿瘤细胞杀伤实验结果证实，该抗体能够有效抑制GPC3阳性的肿瘤细胞的增殖。本专利技术人通过肿瘤细胞增殖抑制实验，证明抗GPC3抗体可以明显抑制肝癌细胞Hep3B的增殖，细胞增殖率降低至约为20％。抗GPC3抗体对GPC3阳性的肝癌细胞具有较好的杀伤作用。附图说明图1为本专利技术实施例1所得纯化全人源抗GPC3的全分子IgG抗体的SDS-PAGE检测结果，其中M为标准标记物，1为抗GPC3抗体，2为细胞培养上清，3为流穿。图2为本专利技术实施例1所得抗GPC3抗体的酶联免疫吸附试验检测结果。图3为本专利技术实施例1所得抗GPC3抗体的免疫印迹鉴定结果，其中1为抗GPC3抗体与GPC3阳性的肝癌细胞Hep3B，2为抗GPC3抗体与GPC3阳性的肝癌细胞A431。图4为本专利技术实施例1所得抗GPC3抗体的亲和力检测结果。图5为本专利技术实施例1所得抗GPC3抗体在体外与肝癌细胞的相互作用。具体实施方式下面，通过具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。实施例1：全人源抗GPC3的全分子IgG抗体的制备1)用GPC3抗原在人源Fab噬菌体库中经过六轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选，获得抗GPC3的Fab抗体，然后通过PCR扩增测序获得Fab抗体的可变区序列；2)根据已获得的抗体的重轻链可变区序列设计引物；3)扩增PA21抗体重链、轻链：以上述制备的人源Fab模板，分别以上述涉及的重链和轻链的上下游引物扩增全分子人源抗体重链、轻链基因。(1)PCR反应体系如下：反应条件如下：(2)2％琼脂糖凝胶电泳，紫外下观察目的条带，切胶回收。(3)胶回收试剂盒纯化目的DNA片段，去离子水洗脱。4)双酶切IgG表达质粒IgG表达质粒pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hk(购自Invivogen公司)包含IgG1型人源的重链和轻链(Kappa)恒定区本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。
【技术特征摘要】
1.一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。2.根据权利要求1所述全分子IgG抗体，其特征在于，所述轻链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述重链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。3.一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体，其特征在于，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述重链恒定...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯振卿，唐奇，许国贞，刘振云，朱进，熊四平，唐小军，
申请(专利权)人：安徽未名细胞治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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