用于鉴定甲型肝炎病毒的引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定甲型肝炎病毒的引物组及其应用。本发明专利技术首先提供了一种特异引物组，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP和引物LB组成，依次如序列1、序列2、序列3、序列4和序列5所示。所述引物组的用途为如下(b1)或(b2)：(b1)鉴定甲型肝炎病毒；(b2)鉴定待测样本是否感染了甲型肝炎病毒。本发明专利技术为甲型肝炎病毒的检测提供了一个新的技术平台，可用于医疗单位筛查和检测甲型肝炎病毒，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定甲型肝炎病毒的引物组及其应用
本专利技术属于生物
中病毒的分子生物学检测方法，具体涉及一种用于鉴定甲型肝炎病毒的引物组及其应用。
技术介绍
甲型肝炎病毒呈球形，直径约为27nm。无囊膜。衣壳由60个壳微粒组成，呈20面体立体对称，有HAV的特异性抗原(HAVAg)，每一壳微粒由4种不同的多肽即VP1、VP2、VP3和VP4所组成。在病毒的核心部位，为单股正链RNA。除决定病毒的遗传特性外，兼具信使RNA的功能，并有传染性。HAV的单股RNA，其长度相当于7400个核苷酸。在RNA的3′末端有多聚的腺苷序列，在5′末端以共价形式连接一由病毒基因编码的细小蛋白质，称病毒基因组蛋白(Viralprotein,genomic,VPG)。它在病毒复制过程中，能使病毒核酸附着于宿主细胞的核蛋白体上进行病毒蛋白质的生物合成。开展甲型肝炎病毒的实验室诊断研究具有重要意义。目前用于甲型肝炎病毒诊断的实验室方法很多，如病毒的分离鉴定、免疫荧光抗体技术、ABC-ELISA试验和琼脂扩散试验等，其中琼脂扩散试验简便、快速，常用于甲型肝炎病毒病毒或血清的检查，但是其敏感性较低，很难在临床上推广应用。为此，急需建立一种敏感、准确、快速、简便的甲型肝炎病毒实验室诊断方法。虽然基于PCR技术的检测方法也已建立，但PCR需要昂贵的仪器，而且操作繁琐。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于鉴定甲型肝炎病毒的引物组及其应用。本专利技术首先提供了一种特异引物组，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP和引物LB组成；所述引物F3为如下(a1)或(a2)；(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物B3为如下(a3)或(a4)；(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物FIP为如下(a5)或(a6)；(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物BIP为如下(a7)或(a8)；(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；引物LB如下(a9)或(a10)；(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。所述引物组的用途为如下(b1)或(b2)：(b1)鉴定甲型肝炎病毒；(b2)鉴定待测样本是否感染了甲型肝炎病毒。本专利技术还保护所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2)：(b1)鉴定甲型肝炎病毒；(b2)鉴定待测样本是否感染了甲型肝炎病毒。本专利技术还保护含有所述引物组的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2)：(b1)鉴定甲型肝炎病毒；(b2)鉴定待测样本是否感染了甲型肝炎病毒。本专利技术还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。本专利技术还保护一种鉴定待测病毒是否为甲型肝炎病毒的方法，包括如下步骤：(1)提取待测病毒的总RNA；(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，采用所述引物组进行逆转录环介导等温扩增；如果采用所述引物组可以实现以所述总RNA为模板的扩增，待测病毒为或候选为甲型肝炎病毒；如果采用所述引物组不能实现以所述总RNA为模板的扩增，待测病毒为或候选为非甲型肝炎病毒。本专利技术还保护一种鉴定待测样本是否感染甲型肝炎病毒的方法，包括如下步骤：(1)提取待测样本的总RNA；(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，采用所述引物组进行逆转录环介导等温扩增；如果采用所述引物组可以实现以所述总RNA为模板的扩增，待测样本为或疑似为感染甲型肝炎病毒的样本；如果采用所述引物组不能实现以所述总RNA为模板的扩增，待测样本为或疑似为未感染甲型肝炎病毒的样本。本专利技术还保护所述引物组在鉴定待测病毒是否为甲型肝炎病毒中的应用。本专利技术还保护所述引物组在鉴定待测样本是否感染了甲型肝炎病毒中的应用。本专利技术还保护一种鉴定待测病毒是否为甲型肝炎病毒的方法，包括如下步骤：检测待测病毒的总RNA中是否含有特异区段，如果待测病毒的总RNA含有所述特异区段、待测病毒为或候选为甲型肝炎病毒，如果待测病毒的总RNA不含有所述特异区段、待测病毒为或候选为非甲型肝炎病毒；所述特异区段为如下(c1)或(c2)：(c1)序列表的序列7自5’末端第27-244位核苷酸所示的RNA；(c2)序列表的序列7所示的RNA。本专利技术还保护一种鉴定待测样本是否含有甲型肝炎病毒的方法，包括如下步骤：检测待测样本的总RNA中是否含有特异区段，如果待测样本的总RNA含有所述特异区段、待测样本为或疑似为含有甲型肝炎病毒的样本，如果待测样本的总RNA不含有所述特异区段、待测样本为或疑似为不含有甲型肝炎病毒的样本；所述特异区段为如下(c1)或(c2)：(c1)序列表的序列7自5’末端第27-244位核苷酸所示的RNA；(c2)序列表的序列7所示的RNA。以上任一所述逆转录环介导等温扩增的反应体系中，各引物的摩尔配比如下：40pmolFIP：40pmolBIP：20pmolLB：5pmolF3：5pmolB3。以上任一所述逆转录环介导等温扩增的反应体系中，每25μl体系含有40pmolFIP、40pmolBIP、20pmolLB、5pmolF3和5pmolB3。以上任一所述逆转录环介导等温扩增的反应体系具体如下(25μl)：模板加入体积为2μl-5μl，溶剂为pH8.8、20mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其在反应体系中的浓度或含量如下：10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、0.1％(体积百分含量)Tween20、0.8M甜菜碱(betaine)、8-10mMMgSO4、1.4mMdNTP(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP的浓度均为1.4mM)、8UBstDNA聚合酶、8U逆转录酶、40pmolFIP、40pmolBIP、20pmolLB、5pmolF3和5pmolB3。以上任一所述逆转录环介导等温扩增的反应条件：65℃恒温60min。以上任一所述待测病毒具体可为甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。以上任一所述甲型肝炎病毒具体可为甲型肝炎病毒BL-08株。以上任一所述乙型肝炎病毒具体可为乙型肝炎病毒adr亚型NC-1毒株。以上任一所述丙型肝炎病毒具体可为丙型肝炎病毒J6CF株。本专利技术提供的引物组具有如下优点：(1)高特异性：5条引物对甲型肝炎病毒靶序列的7个特异区域的识别保证了RT-LAMP扩增的高度特异性，即RT-LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；(2)高灵敏度：灵敏度比普通PCR高10倍；(3)结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果(钙黄绿素显色)，也可以直接用浊度仪判断结果；(4)操作简单：只要将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入65℃恒温水浴锅中60分钟后就可以判断结果；(5)快速、高效扩增：整本文档来自技高网...

【技术保护点】
引物组，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP和引物LB组成；所述引物F3为如下(a1)或(a2)；(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物B3为如下(a3)或(a4)；(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物FIP为如下(a5)或(a6)；(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物BIP为如下(a7)或(a8)；(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；引物LB如下(a9)或(a10)；(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.引物组，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP和引物LB组成；所述引物F3为如下(a1)或(a2)；(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物B3为如下(a3)或(a4)；(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物FIP为如下(a5)或(a6)；(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物BIP为如下(a7)或(a8)；(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；引物LB如下(a9)或(a10)；(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。2.权利要求1所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2)：(b1)鉴定甲型肝炎病毒；(b2)鉴定待测样本是否感染了甲型肝炎病毒。3.含有权利要求1所述引物组的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2)：(b1)鉴定甲型肝炎病毒；(b2)鉴定待测样本是否感染了甲型肝炎病毒。4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。5.一种鉴定待测病毒是否为甲型肝炎病毒的方法，包括如下步骤：(1)提取待测病毒的总RNA；(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，采用权利要求1所述引物组进行逆转...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雪梅，于杰，李辉，李献刚，卢芙蓉，吴斌，李奉京，
申请(专利权)人：中华人民共和国东港出入境检验检疫局，北京蓝谱生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21