一种同步检测5种西瓜病毒的多重RT-PCR方法及其应用技术

本发明专利技术属于农作物病害诊断和分子生物学技术领域，公开了一种同步检测5种西瓜病毒的多重PCR方法，该PCR体系中含有5对特异性引物(SEQ ID NO1～10)，在一个PCR体系中同步对5种病毒进行扩增，得到了1464bp、1023bp、810bp、600bp和327bp的特异性条带，建立并优化了能同步检测CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV的多重RT‑PCR反应体系。检测结果表明优化后的多重RT‑PCR反应体系能对田间样品进行快速、高效地、准确的检测。对监测西瓜上CiLCV等5种常见病毒病在田间的发生情况以及病害流行预测具有十分重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种同步检测5种西瓜病毒的多重RT-PCR方法及其应用
本专利技术属于农作物病害诊断和分子生物学
，特别是涉及一种反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的体系及其应用，利用该体系可通过一次PCR检测5种侵染西瓜的RNA病毒，达到准确、快速、高效检测的目的。
技术介绍
西瓜(Citrulluslanatus)是葫芦科西瓜属植物，为夏季水果，果肉鲜甜多汁，能降温去暑；种子含油，可作消遣食品；果皮可药用，有清热、利尿、降血压的功效。自1978年以来，世界西瓜生产持续发展，种植面积、总产量和单产均有大幅提高。据联合国粮食与农业组织统计数据库(FAOSTAT)2013年的数据，全世界共有117个国家种植西瓜，西瓜的种植总面积和产量分别为348.921万公顷和10927.87万吨,位列水果的第7位和第1位；我国是最大的西瓜生产国，2013年种植面积和产量分别为183.98万公顷和7318.88万吨，占全世界52.73％和66.97％。随着西瓜种植面积的不断扩大，种植区气候和耕作制度的变化，西瓜病毒病的发生呈现逐年上升趋势，重病田发病率约为30～50％,甚至高达85％，严重影响了西瓜的产量、品质以及农民的种植积极性。目前在我国能够引起西瓜病毒病害的主要病原有：马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)和西瓜花叶病毒(Watermelonmosaicvirus,WMV)，烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)和烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)，马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的甜瓜蚜传黄化病毒(Melonaphid-borneyellowsvirus,MABYV)、豇豆花叶病毒属(Comovirus)的南瓜花叶病毒(Squashmosaicvirus,SqMV)、黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)以及丁型双分病毒属(Deltapartitivirus)的西瓜潜隐病毒(Citrulluslanatuscrypticvirus,CiLCV)。在自然条件下，西瓜植株受到2种或2种以上病毒复合侵染的情况非常普遍，往往会导致病害症状复杂，难以识别病原种类，给病害早期诊断、监测预警和田间有效防控带来极大的困难。2015和2016年在河南开封西瓜田发生了严重的病毒病害，经小RNA深度测序和PCR鉴定发现存在CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV5种病毒单一或两种以上病毒不同组合的复合侵染型，最多5种病毒可以同时侵染一株西瓜苗。但由于小RNA深度测序成本昂贵，且需要较高的生物信息学分析技能，难以大规模应用于生产实践。因此生产上急需一种快速、准确、简单、易操作的方法同时鉴别多种病毒病原。随着分子生物学技术的长足发展，基于核酸操作的多项技术在病毒病害的检测中发挥了巨大的作用，如多聚酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR、基因芯片、核酸等温扩增等技术可同时检测多个靶标病原物，具有快速、准确、样品消耗少等特点。多重PCR(multiplexPCR)技术因其快速、灵敏、准确等优点已被广泛应用于病毒、细菌、真菌等病原物的检测和鉴定，为病害的早期诊断发挥着巨大的作用。多重PCR是指在同一个PCR反应体系中同时加入两种或两种以上的靶标病原物的核苷酸模板和特异性引物对，通过一次扩增反应获得大小不同的两种或两种以上的目的基因片段，从而同时区别两种或两种以上靶标病原物。基于此原理，本专利技术建立了CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV等5种病毒的一步法RT-PCR检测体系，该体系可以准确、高效、快速的鉴定田间自然发病的西瓜标样，为西瓜病害的早期诊断和鉴定提供手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于同步检测五种侵染西瓜的病毒病原的方法。该方法能够准确、高效、灵敏的同时检测多种西瓜病毒病原。一种同步检测CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种西瓜病毒的多重RT-PCR方法，在同一PCR体系中，包含有如下特异性引物对：扩增CiLCV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.1：5′-CATTGGTGGAGCACAAAACAAA-3′，SEQIDNO.2：5′-TTGCGTCTTAGCCTATCTGC-3′；扩增CGMMV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.3：5′-GTTGCGAGGAATGTGATGTA-3′，SEQIDNO.4：5′-AAGACTGTCTGCGAACCTCC-3′；扩增ZYMV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.5：5′-AGCAAACTGTGGCAGACGCT-3′，SEQIDNO.6：5′-CTAGTAAGGTATGCATGTTT-3′；扩增MABYV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.7：5′-TTGGAGGTTATGCAGATTTTCG-3′；SEQIDNO.8：5′-GCCGGTCATCAGTATCAAGTCT-3′；扩增WMV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.9：5′-TCGAATACAAGCCCAATCAA-3′；SEQIDNO.10：5′-ACGGACTTTCAGAGTTTCTC-3′。所述PCR体系中CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV引物的摩尔比为3：4：4：3：3。所述的PCR体系总体积25μL，其中含有cDNA2μL、10mmol/LdNTPs3μL、rTaq5U、25mmol/L的MgCl21.5μL以及10μmol/L的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV上下游引物分别为0.3μL、0.4μL、0.4μL、0.3μL、0.3μL。所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性3分钟；按照以下条件进行40个循环：94℃变性30秒、55℃复性45秒、72℃延伸90秒；循环结束再72℃延伸10分钟。上述方法在同步检测农作物五种西瓜病毒病原CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV中的应用。所述农作物为西瓜。一种检测试剂盒，含有上述五对引物。本专利技术提供的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种病毒的特异性引物对，通过RT-PCR分别可以获得1464bp，1023bp，810bp，600bp和327bp的单一的特异性条带。通过对PCR反应体系和条件的优化，建立了同步检测上述五种病毒的多重RT-PCR体系，突破了同步检测侵染西瓜的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV等五种病毒的技术瓶颈，也可以为其他病毒病原的鉴定提供借鉴。具体
技术实现思路
涉及到：1)病毒RNA的提取；2)特异性引物对的设计和特异性分析；3)五种病毒的单重PCR鉴定体系；4)多重PCR检测体系的建立与优化；5)多重PCR体系灵敏度的测定；6)多重PCR体系在田间样品检测中的应用。本专利技术的多重PCR的最佳体系和条件经优化确定为：10mmol/LdNTPs3μL、rTaq5U、25mmol/LMgCl21.5μL，以及55℃的退本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同步检测CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种西瓜病毒的多重RT‑PCR方法，在同一PCR体系中，包含有如下特异性引物：扩增CiLCV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1：5′‑CATTGGTGGAGCACAAAACAAA‑3′，SEQ ID NO.2：5′‑TTGCGTCTTAGCCTATCTGC‑3′；扩增CGMMV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.3：5′‑GTTGCGAGGAATGTGATGTA‑3′，SEQ ID NO.4：5′‑AAGACTGTCTGCGAACCTCC‑3′；扩增ZYMV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.5：5′‑AGCAAACTGTGGCAGACGCT‑3′，SEQ ID NO.6：5′‑CTAGTAAGGTATGCATGTTT‑3′；扩增MABYV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.7：5′‑TTGGAGGTTATGCAGATTTTCG‑3′；SEQ ID NO.8：5′‑GCCGGTCATCAGTATCAAGTCT‑3′；扩增WMV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.9：5′‑TCGAATACAAGCCCAATCAA‑3′；SEQ ID NO.10：5′‑ACGGACTTTCAGAGTTTCTC‑3′。...

【技术特征摘要】
1.一种同步检测CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种西瓜病毒的多重RT-PCR方法，在同一PCR体系中，包含有如下特异性引物：扩增CiLCV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.1：5′-CATTGGTGGAGCACAAAACAAA-3′，SEQIDNO.2：5′-TTGCGTCTTAGCCTATCTGC-3′；扩增CGMMV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.3：5′-GTTGCGAGGAATGTGATGTA-3′，SEQIDNO.4：5′-AAGACTGTCTGCGAACCTCC-3′；扩增ZYMV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.5：5′-AGCAAACTGTGGCAGACGCT-3′，SEQIDNO.6：5′-CTAGTAAGGTATGCATGTTT-3′；扩增MABYV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.7：5′-TTGGAGGTTATGCAGATTTTCG-3′；SEQIDNO.8：5′-GCCGGTCATCAGTATCAAGTCT-3′；扩增WMV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.9：5′-TCGAATACAAGCCCAATCAA-3′；SEQIDNO.10：5′-ACGGACTTTCAGAGTTTCTC-3′。2.根据权利要求1所述的方法，所述PCR体系中CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV引物的摩尔比分别为3：4：4：3：3。3.根据权利要求2所述的方法，所述的PCR体系总体积25μL，其中含有cDNA2μL、10mmol/LdNTPs3μL、rTaq1.5U、25mmol/L的MgCl21.5μL以及10μmol/L的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV上...

【专利技术属性】
技术研发人员：李莉，冯耿，王锡锋，刘文文，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11