一种鳜传染性脾肾坏死病毒灭活快速检验试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种鳜鱼传染性脾肾坏死病毒灭活快速检测试剂盒和检测方法。该检测试剂盒和检测方法是通过对病毒mRNA的检测来监测ISKNV是否灭活，具体步骤是将灭活疫苗半成品或成品接种CPB细胞后7天，提取细胞总RNA，去除DNA残留，进行反转录，然后用针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ORF099 基因保守区序列设计特异引物和探针进行荧光定量PCR反应，根据反应结果判定病毒是否灭活完全。本发明专利技术可对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒灭活进行快速检测，可以简化ISKNV细胞灭活疫苗灭活检验操作程序、缩短检验周期、节约成本，提高了灭活检验灵敏度，提高疫苗生产效率。

A kind of infectious spleen and kidney necrosis virus inactivated rapid detection kit and detection method

The invention discloses a mandarin fish infectious spleen and kidney necrosis virus inactivated fast detection kit and detection method. The detection kit and the detection method is through the detection of mRNA virus to monitor ISKNV inactivation, the specific steps will be inactivated vaccine 7 days of semi-finished or finished products after inoculation of CPB cells, total cellular RNA was extracted, removal of residues of DNA, reverse transcription, and then using fluorescence quantitative PCR reaction according to the conserved sequence of infectious spleen and kidney necrosis virus ORF099 gene in Siniperca designed specific primers and probe, according to the reaction result to determine whether the virus inactivated completely. The invention of infectious spleen and kidney necrosis virus inactivated rapid detection, which can simplify the inactivated ISKNV cells vaccine inactivated inspection procedures, shorten the test cycle and save the cost, improve the inspection sensitivity of inactivated vaccine production, improve efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种鳜传染性脾肾坏死病毒灭活快速检验试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种传染性脾肾坏死病毒灭活快速检测试剂盒及检测方法，具体涉及一种基于病毒mRNA监测的ISKNV灭活快速检测荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
鳜(Sinipercachuatsi)是我国优质淡水鱼消费和出口创汇的重要品种，因其味道鲜美，蛋白质含量高而深受广大消费者的喜爱。然而严重的病害问题已成为限制鳜鱼养殖业发展的主要瓶颈。鳜传染性脾肾坏死病毒病(Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)，具有发病率高、致病率高、造成经济损失大等特点，其防控技术研究成为鱼病研究者重要课题之一。疫苗接种是预防鱼类病毒病最经济有效手段，细胞灭活疫苗因具有制备简便、免疫效果稳定、研发周期短而成为最具产业前景的商品化疫苗之一。病毒灭活检验是ISKNV细胞灭活疫苗制备中重要的一环，但传统病毒灭活检测方法是通过细胞盲传3代、同时通过接种鱼体验证病毒是否灭活完全，整个过程约需30天的时间，这大大延长了疫苗生产周期，降低了疫苗的生产能力，因此急需建立一种ISKNV灭活快速检验方法。病毒在细胞增殖过程中病毒相关基因持续转录，因此可对病毒mRNA进行监测而检验病毒是否灭活。针对RNA病毒，余芬等采用链特异性RT-PCR建立了一种脊髓灰质炎病毒灭活快速验证方法；Kim等以黄瓜绿斑花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)基因组热敏感区为靶标建立了该病的热灭活RT-PCR快速检测方法；针对DNA病毒，Yuasa等通过RT-PCR监测锦鲤疱疹病毒(koiherpesvirus，KHV)mRNA来检测复制中的病毒。而针对鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)灭活快速检测方法尚未见报道。本专利技术从ISKNV感染CPB细胞系后表达谱结果中挑选表达量最高病毒早期基因为靶标基因，以该基因mRNA监测作为病毒是否灭活完全指标，建立ISKNV灭活快速检测荧光定量RT-PCR方法，旨在缩短ISKNV细胞灭活疫苗生产过程中灭活检验周期，提高疫苗生产效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种传染性脾肾坏死病毒灭活快速检测试剂盒及检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：从ISKNV感染CPB细胞系后表达谱结果中挑选5个表达量最高病毒早期基因，经qRT-PCR确认ORF099基因表达量最高，选择其作为病毒灭活快速检测的靶标基因。设计特异性反转录引物、荧光定量PCR引物和探针，采用qRT-PCR对待测样品接种CPB细胞后7d的细胞总RNA进行检测，如检测到ISKNVmRNA则表明存在活的ISKNV，反之则无。一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括如下组分：针对鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)特异性引物及探针、反转录酶、Taq酶、反转录反应液、荧光定量反应液。优选的，所述针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的特异性引物及探针是根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ORF099基因保守区序列设计的。优选的，所述针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的特异性引物及探针的序列如下所示：ORF099-F:5’-ACTTGGCTTCCACACAATCC-3’(SEQIDNO:1)；ORF099-R:5’-ATGCTGTGCTGTCATCTTGC-3’(SEQIDNO:2)；ORF099-P:5’FAM+ATTGGCATCCAAGCCAATATACATGGC+TAMARA3’(SEQIDNO:3)，探针序列两端为发光基团和猝灭基团。优选的，所述试剂盒中还含有阳性标准品，所述阳性标准品为鳜传染性脾肾坏死病毒。一种鳜传染性脾肾坏死病毒灭活快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将待测的ISKNV细胞灭活疫苗成品或半成品按一定比例稀释后接种CPB细胞，同时将阳性标准品接种细胞作为对照；2)接种细胞后7d，提取细胞总RNA，并去除其中残留DNA；3)处理后总RNA经试剂盒中反转录引物和酶进行反转录后，用试剂盒中的引物、探针、Taq酶、反应液进行荧光定量PCR，同时用不加模板的反应体系作为空白对照；4)当阳性样品出现峰，空白对照不起峰时，待测样品起峰为阳性，代表灭活不完全；待测样品不起峰为阴性，代表灭活完全。优选的，所述检测方法中采用的试剂盒的引物为：ORF099-F:5’-ACTTGGCTTCCACACAATCC-3’(SEQIDNO:1)；ORF099-R:5’-ATGCTGTGCTGTCATCTTGC-3’(SEQIDNO:2)。优选的，所述检测方法中采用的试剂盒的探针为：ORF099-P:5’FAM+ATTGGCATCCAAGCCAATATACATGGC+TAMARA3’(SEQIDNO:3)，探针的两端链接发光基团和猝灭基团。本专利技术的有益效果是：该方法灵敏度超过细胞盲传法和鱼体安全试验方法。3批次的ISKNV细胞灭活疫苗样品验证结果表明，该方法稳定性与细胞盲传法、鱼体安全试验法一致，表明本研究建立的基于病毒mRNA的qRT-PCR监测的病毒灭活快速检测方法可以替代传统的细胞盲传法和鱼体安全方法，实现ISKNV灭活的快速检测。而灭活检验周期长短对疫苗生产周期起决定性作用，本研究建立ISKNV灭活快速检验方法7天即可判断病毒是否灭活，而传统的细胞盲传法和鱼体安全试验周期至少需要24天和21天，因此，该方法可大大缩短ISKNV灭活疫苗生产周期，提高疫苗的生产效率。附图说明图1，ISKNV感染CPB细胞总RNA中gDNA去除验证；(a):表示稀释病毒液接种CPB细胞7天(U-A，R-A)和11天(U-B，R-B)后提取的RNA样品，U-A\U-B表示未去除gDNA的RNA，R-A\R-B表示去除gDNA后的RNA；(b)表示0.05％、0.1％和0.2％终浓度甲醛灭活ISKNV72h后接种CPB细胞9天获得的RNA样品，U-C表示未去除gDNA的RNA，R-C表示去除gDNA后的RNA；图2，荧光定量RT-PCR检测ISKNV感染CPB细胞后病毒基因转录数量。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1.目标基因的筛选根据本实验室已有的ISKNV感染CPB细胞转录谱结果，选取表达量最高的5个病毒ORF，应用Primer5.0软件设计特异性引物和探针(见表1)。将ISKNV梯度稀释成1、10、100、1000拷贝/mL分别接种T25细胞培养瓶，接种7天后提取总RNA反转录制备cDNA模板。采用PremixExTaqTM(ProbeqPCR)试剂盒检测这些基因的表达量。反应体系：依次加入Mix10μL、ROX0.4μL、10μmol/L引物ISKNVFP/ISKNVRP各0.4μL、10μmol/L探针ISKNVprobe0.4μL、2μL模板、补水至20μL。阴性对照组以去离子水代替待测样品。反应条件为：95℃30s，1个循环；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃时采集荧光信号。结合转录组结果筛选出一个检测灵敏度较高的基因作为灭活检验靶标基因。如表2所示，ISKNV感染CPB细胞24h的转录谱结果显示，相对表达量前5位病毒基因依次为ORF023、ORF09本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种传染性脾肾坏死病毒灭活快速检测试剂盒，包括如下组分：针对鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）的特异性引物及探针、反转录酶、Taq酶、反转录反应液、荧光定量反应液。

【技术特征摘要】
1.一种传染性脾肾坏死病毒灭活快速检测试剂盒，包括如下组分：针对鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）的特异性引物及探针、反转录酶、Taq酶、反转录反应液、荧光定量反应液。2.根据权利要求1所述的ISKNV灭活快速检测试剂盒，其特征在于，所述针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）的特异性引物及探针是根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ORF099基因mRNA保守区序列设计的。3.根据权利要求1或2所述的ISKNV灭活快速检测试剂盒，其特征在于，所述针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF099基因mRNA特异性引物及探针的序列如下所示：反转录引物：ORF099-F:5’-acttggcttccacacaatcc-3’（SEQIDNO:1）；ORF099-R:5’-atgctgtgctgtcatcttgc-3’（SEQIDNO:2）；ORF099-P（探针）:5’FAM+Attggcatccaagccaatatacatggc+TAMARA3’（SEQIDNO:3），探针的两端链接发光基团和猝灭基团。4.根据权利要求1所述的ISKNV灭活快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有阳性标准品，所述阳性标准品为含有鳜传染性脾肾坏死病毒。5.一种鳜传...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宁求，付小哲，张醴溪，林强，刘礼辉，梁红茹，黄志斌，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44