大规模生产甲型肝炎病毒的方法技术

本发明专利技术提供在与微载体结合的ＶＥＲＯ细胞中大规模生产甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）的方法。本发明专利技术也提供从ＨＡＶ感染的ＶＥＲＯ细胞的细胞培养物的上清液中分离ＨＡＶ的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在与微载体结合的VERO细胞中大规模生产甲型肝炎病毒(HAV)的方法。本专利技术也提供从HAV感染的VERO细胞的细胞培养物上清液中分离HAV的方法。
技术介绍
甲型肝炎持续引起传染病、地方病、偶然死亡的散发病例并且是全世界的公共卫生问题。感染是由一组小的无包膜RNA病毒，细小核糖核酸病毒家族的成员甲型肝炎病毒(HAV)引起的。病毒颗粒直径为27-32nm并由单个多肽前体分子切割而成的三个多肽组成。成熟的病毒由多肽VP1、VP2和VP3组成。衣壳蛋白VP1和VP3含有主要的抗原位点并能诱导中和抗体(Lemon等人，1989，在Semler等人编辑的细小核糖核酸病毒的分子状况和检测(Molecular aspects ofpicornavirus and detection.)华盛顿特区ASM第193-208页中)。甲型肝炎病毒(HAV)是可从细胞培养物中分离的唯一嗜肝病毒，但该病毒通常伴随较长的培养期和无致细胞病变效应而难以繁殖。Binn等人(1984，临床微生物学杂志(J.Clincal.Microbiol.)，2028-33)测试了用于复制HAV的几种灵长类细胞类型和用于分离和生产大量病毒的最适条件。HAV的无血清生产显示在异双倍体细胞系BSC-1细胞中，该细胞系直到现在也未用于制备施用于人类的疫苗。在滚瓶中培养21天后，可在上清液和细胞部分中发现病毒抗原。培养在无血清培养基中的细胞与含血清培养的细胞同样支持病毒的生长。候选HAV疫苗从培养于无血清培养基的感染的BSC-1细胞的细胞和上清液体中获得(Binn等人，1986，传染疾病杂志(J.Infect.Diseases)，153749-756)。然而，Simmonds等人(1985，环境微生物学应用(Appl.Enviromental Microbiol.)，49749-755)发现在2％-15％的不同浓度血清的培养基中持续感染的细胞BSC-1或AGMK细胞的HAV产量没有显著差异。初级AGMK细胞中的病毒产量是BSC-1细胞中产量的两倍，但是产生的HAV主要保持细胞伴随状态并且只在培养液体中发现了少许病毒。Nasser等人(1987，环境微生物学应用(Appl.EnviromentalMicrobiol.)，532967-2971)报道在FRhK-4细胞培养物中以BSC-1培养物所需时间的一半或更少的时间产生了约七倍于BSC-1培养物的更多HAV，其中与细胞结合的HAV相对于BSC-1细胞释放的HAV的比率分别计算为80％对20％。Flehmig等人(1987，医学病毒学杂志(J.Medical Virol.)，227-16)从生长于含血清的培养基中的持续感染的正常人胚胎成纤维细胞的细胞培养物上清液中制备HAV。使用这些方法，在NUNC细胞工厂里生产了大量的上清液并且从上清液分离和经多重步骤纯化的HAV抗原可用于接种疫苗测试。即使已经报道了几种灵长类细胞类型支持HAV的复制，例如胎性恒河猴肾细胞系(FRhK-4)、原代非洲绿猴肾细胞(AGKM)、传代非洲绿猴肾细胞(BCS-1)，这些细胞通常不被用于人类疫苗，因为已知猴肾经常具有高含量的潜伏猿猴病毒。其他细胞系由于这些细胞的致瘤特性而不能使用。大量生产原代人上皮细胞、成纤维细胞或肾细胞或细胞株以繁殖HAV也受限于这些细胞在培养中的低传代数量。事实上，世界卫生组织(WHO)的适用方针指出只有少数的细胞系被允许用于病毒疫苗的生产。目前被接受并被批准用于生产适用于人类的疫苗的细胞系是VERO细胞。VERO细胞是已被许可用于人类疫苗制造和目前用于生产脊髓灰质炎和狂犬病疫苗的传代猴肾细胞系。已经尝试利用VERO细胞生产HAV，但是已发现VERO细胞中HAV的复制受到限制，因为VERO具有病毒生长的温度限制。此外，从未在感染细胞的上清液体中发现病毒(Locarnini等人，1981，病毒学杂志(J.Virol.)，37216-225)。美国专利号4,783,407公开了在不高于33℃的温度下于滚瓶中的VERO细胞中生产HAV以克服温度限制。通过冻融培养的细胞并释放细胞内生产的病毒而获得HAV。基于在VERO细胞中繁殖HAV的商业化疫苗从未被描述。迄今为止，甲醛溶液灭活的HAV疫苗已被生产以用于临床试验(Andre等人，1990，在Melnick编辑的医学病毒学进展(Prog.Med.Virol.)，Basel，Karger 3772-95中，Armstrong等人，1993，肝脏学杂志(J.Hepatology)，1820-26)并且能从初次感染中诱导长时间持久免疫和保护的两种疫苗已是商业化适用的。目前适用的灭活HAV全病毒疫苗的生产方法使用人胚胎肺成纤维细胞系MRC-5作为Nunc细胞工厂(NCF)中的宿主细胞，其中用于疫苗生产的HAV抗原是从细胞内产生的病毒的细胞裂解物获得的，因为HAV抗原不能有效地释放到培养物的上清液中，而且浓缩大体积液体的方法是昂贵的(Bishop等人，1994，病毒学方法杂志(J.Virol.Meth.)，47203-216)。来自细胞裂解物和细胞培养物上清液含有病毒体和原病毒体混合群HAV的大规模制剂(Bishop等人，1997，Arch.Virol.1422147-2160)以及商业化适用的疫苗包含完全成熟的病毒体和空的原病毒体颗粒(Andre 1990同上，Armstrong 1993同上)。此外，MRC-5细胞在组织培养中生长缓慢且需要胎牛血清。在细胞培养中使用血清和/或使用衍生自动物或人来源的蛋白质添加剂出现的问题(例如，不同批次的变化的品质和组成以及受支原体、病毒或BSE试剂污染的风险)是已知的。一般来说，血清或衍生自如白蛋白、运铁蛋白或胰岛素的物质的血清可能含有会污染培养物和衍生自它们的生物产品的不需要的试剂。此外，必须测试人血清衍生的添加剂中能够由血清传染的所有已知病毒，如肝炎或HIV。牛血清或其衍生产品，例如胰蛋白酶，要承受BSE污染的风险。此外，所有血清衍生产品都可能被未知试剂污染。因此，作出许多尝试以提供不需要血清或其他血清衍生的化合物的有效宿主系统和培养条件。生产方法和培养基一样重要。经济上可行的唯一方法是反应器方法，因为可适应于市场的大小和所需疫苗的剂量按比例扩大规模。对于贴壁细胞使用经典微载体的载体方法是目前用于病毒繁殖所需的细胞的大规模培养的最好选择。目前基于微载体培养的方法容许使用高达几千升大小的发酵罐生产病毒抗原。Widell等人(1984，病毒学方法杂志(J.Virol.Methods)，863-71)使用FRhK-4细胞的微载体细胞培养系统来大规模生产HAV并发现了细胞内和细胞外病毒。每个使用微载体系统的细胞的病毒产量与生长于培养瓶中的常规培养物相似。另一方面，Junker等人(1992，细胞工程学(Cytotechnol.)，9173-187)显示HAV感染的与常规Cytodex微载体结合的MRC-5细胞由于MRC-5细胞倾向于形成微载体和细胞的凝集物而与生长于培养瓶中的细胞相比只生产30％的HAV抗原。WO95/24468公开了在灌流系统中MRC-5细胞生长于凝集的玻璃包被的微载体上以用于HAV生产，其中在细胞中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于连续生产甲型肝炎病毒的方法，包括下列步骤：提供与微载体结合的ＶＥＲＯ细胞的无血清细胞培养物，用ＨＡＶ感染该ＶＥＲＯ细胞的无血清细胞培养物，孵育用ＨＡＶ感染的该ＶＥＲＯ细胞的无血清细胞培养物以繁殖所述的ＨＡＶ，其中ＨＡＶ被连续地释放到细胞培养基中；以及收获所述释放到细胞培养基中的ＨＡＶ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：H迈尔，M赖特尔，W蒙德特，N巴雷特，F多纳，
申请(专利权)人：巴克斯特健康护理股份有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]