本发明专利技术公开了一种用于联合检测三种发热伴出疹病毒的液相芯片非诊断性方法及其制备方法，包括：用带有生物素标记的引物进行发热伴出疹病毒PCR扩增，根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性捕获探针；捕获探针分别与相应的编码微球偶联，该捕获探针在一定的条件下特异的与PCR产物结合；加入链霉亲和素-藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用液相芯片Luminex系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析。本发明专利技术检测灵敏度高，特异性好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种可同时检测肠道病毒71 (Enterovirus 71 )、柯萨奇病毒A组16(Coxsackievirus A 16)和麻疫病毒(Measles virus)的液相芯片非诊断性方法以及对其液相芯片的制备方法和应用。
技术介绍
发热伴出疹症候群是以发热、出疹为主要症状，同时伴有其他临床症状的一组疾病。常见的病原体包括肠道病毒71 (Enterovirus 71，EV71)、柯萨奇病毒A组16(Coxsackievirus A 16, CA16)、麻疫病毒(Measles virus, MV)、风疫病毒、登革病毒等。其中，EV71和CA16分别是导致重症和轻症手足口病的主要病原体，麻疹病毒是麻疹的主要病原体。这类疾病在潜伏期时就具有传染性。因此，在疾病的早期开展对该症候群病原的筛 查，对随后的隔离、采取相应的防控措施等具有指导意义。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR,是一种模拟天然DNA复制的体外扩增法。PCR技术的问世给分子诊断带来一场革命。PCR技术已经成为分子诊断的基础。目前PCR产物的检测方法为琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶仅约可区分相差IOObp的DNA片段。片段长度相差不大或者相等的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳将无能无力。另外，琼脂糖凝胶电泳通过紫外光激发荧光染料产生荧光来判断是否存在PCR产物，检测灵敏度相对较低。且琼脂糖凝胶电泳通过片段的大小对产物进行判断，特异性差，对非特异扩增的大小相似的片段不能区分。而且常用的染料如溴化乙锭等具有致癌性，常操作对身体健康不利。液相芯片(liquid chip),也称悬浮芯片(suspension array),是一种非常灵活的多功能检测技术平台，可以进行蛋白、核酸等生物大分子检测、受体和配体识别分析等研究。液相芯片主要通过偶联探针的荧光编码微球与两束激光检测，对被测物定性和定量分析，一个反应孔内可以完成100种不同的生物学反应。可实现对核酸的多重检测。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种检测灵敏度高，特异性好，尤其适用于多重PCR产物相似长度片段不易区分，且理论上可对100种不同的PCR产物进行区分，实现100种不同因子的多重检测。现有的病原检测技术受限于多重检测能力的困境，而许多可疑样本需要进行多病原的筛查，本专利技术的目的是通过提供一种联合检测三种病毒的液相芯片非诊断方法及其制备方法和应用，为三种发热伴出疹病原的快速检测提供一种灵敏、特异、快速、可靠的方法。本专利技术采用的技术方案是选择三种病毒的特异基因片段，设计针对三种病毒的特异性引物；然后设计位于扩增区域内的三种病毒的特异性探针，探针偶联不同编号的编码微球，制备建立出可对以上三种病毒同时检测的液相芯片方法，在应用时，首先使用上述引物对三种病毒进行多重PCR扩增产物，与偶联有探针的编码微球结合，再与链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)反应,之后通过悬浮芯片检测系统(如Luminex 100, Luminex 200,Bio-plex, Liquichip等),实现对三种发热伴出疫病毒的一次性检测。为实现上述目的，本专利技术提供一种用于联合检测三种发热伴出疹病毒的液相芯片非诊断性方法，包括I)用带有生物素标记的特异性引物进行三种发热伴出疹病毒PCR扩增；2)偶联有捕获探针的编码微球在一定的条件下捕获探针特异的与带有生物素标记的PCR产物结合；3)加入链霉亲和素一藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片Luminex系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析。 进一步，所述发热伴出疹病毒包括肠道病毒71 (EV71)、柯萨奇病毒A组16(CA16)和麻疹病毒(MV)。进一步，所述EV 71、CA16和MV的引物序列为权利要求1.一种用于联合检测三种发热伴出疹病毒的液相芯片非诊断性方法，其特征在于，该非诊断性方法包括 1)用带有生物素标记的引物进行发热伴出疹病毒多重PCR扩增； 2)偶联有捕获探针的编码微球在一定的条件下，捕获探针特异的与带有生物素标记的PCR产物结合； 3)加入链霉亲和素-藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片Luminex系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析。2.如权利要求I所述的非诊断性方法，其特征在于，所述发热伴出疹病毒包括肠道病毒71、柯萨奇病毒A组16和麻疫病毒。3.如权利要求2所述的非诊断性方法，其特征在于，所述肠道病毒71、柯萨奇病毒A组16和麻疹病毒的引物序列为4.如权利要求3所述的非诊断性方法，其特征在于，所述引物序列中Reverse5’端加Biotin 标记。5.如权利要求I所述的非诊断性方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为cDNA模板2ul，PCR预混液15ul，各病毒上下游引物(lOumol/L) Iul，去离子水补足30ul。反应条件5(TC 30min ；94°C 2min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 45s, 30 个循环；72°C IOmin06.一种用于联合检测三种发热伴出疹病毒的液相芯片非诊断性方法其液相芯片的制备方法，该方法包括 1)根据待检测的PCR产物，选择设计位于扩增区域内的特异的捕获探针； 2)捕获探针和互补探针合成； 3)相应的捕获探针偶联编码微球； 4)捕获探针偶联微球的验证。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述EV71、CA16和MV的捕获探针及其互补序列序列为8.如权利要求7所述的，其特征在于，所述序列中每个probe5’端加12个C或20个T再加-NH2修饰；RC-probe 5，端加Biotin标记。9.如权利要求6所述的液相芯片制备方法，其特征在于，所述步骤2)中探针与微球偶联时的方法，包括以下步骤 a)分别选取不同编号的编码微球，用漩涡振荡器振荡微球悬液，使微球混合均匀； b)分别取上述微球大约1.25X IO6个,分别转移至离心管，14000g离心3 5min,小心吸出上清；c)加入50μ LO. ImoI/L的2-(η-吗啉代)乙磺酸溶液，振荡20 30S，超声20 30s，使微球重悬； d)用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释到O.lmmol/L ； e)将I 5μL稀释的探针加于微球悬浮液中，振荡混匀；f)加入2.5 μ L新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液至微球与探针混和液中，振荡混匀；g)用铝箔包裹离心管避光，漩涡振荡器上400 600rpm振荡，室温孵育30min； h)再次加入新鲜配制的10mg/mLEDC ； i)再次在漩涡振荡器上400 600rpm振荡，室温避光孵育30min； j)用 0. 02%PBST Iml 洗涤 I 次，离心 14000g 3 5min ； k)移弃上清，微球重悬于Iml 0. 1%SDS中，洗涤，离心； I)移弃上清，微球重悬于IOOyL pH8. OTE中，振荡悬起混匀，即得到偶联好的检测微球。10.如权利要求6所述的制备方本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于联合检测三种发热伴出疹病毒的液相芯片非诊断性方法，其特征在于，该非诊断性方法包括：1）用带有生物素标记的引物进行发热伴出疹病毒多重PCR扩增；2）偶联有捕获探针的编码微球在一定的条件下，捕获探针特异的与带有生物素标记的PCR产物结合；3）加入链霉亲和素？藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片Luminex系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽娟，杨永莉，王莎莎，王静，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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