一种抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒，所述试剂盒包括：生物素化的双链DNA抗原、链亲和素包被的磁微粒、吖啶酯标记的鼠抗人IgG单克隆抗体、抗双链DNA抗体IgG定标品、预激发液、激发液。另外本发明专利技术还公开了一种抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒的制备方法。本发明专利技术所述试剂盒与现有试剂盒相比操作简便，灵敏度高，检测范围广等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及体外诊断免疫检测领域，具体地，本专利技术提供了一种化学发光免疫检测抗双链DNA抗体IgG试剂盒及其制备方法。
技术介绍
双链脱氧核糖核酸（doublestrandedDNA,dsDNA）抗体是一种能够与天然DNA结合的自身抗体。在90%以上活动的系统性红斑狼疮（SLE）病人的血清中均存在抗双链DNA抗体，双链DNA抗体与SLE的病理变化、活动性、疗效及预后有很密切的关系。SLE是严重危害人类健康的自身免疫性疾病，好发于青年女性，可累及全身各个系统。SLE疾病的重要免疫学特征是自身抗体的产生，自身抗体不仅对疾病的诊断具有重要价值，在疾病发病中也有重要作用；其中，dsDNAIgG抗体是系统性红斑狼疮标志性抗体，几乎存在于所有患者的血清中，与临床表现密切相关，它是SLE活动期的标志。有研究证明，抗dsDNA抗体和DNA结合成为免疫复合物在肾小球基底膜沉积，或抗体直接作用于肾小球抗原而造成SLE患者的肾损伤。dsDNAIgG抗体测定对于SLE的诊断和鉴别诊断、监视治疗和病情追踪以及判断预后等有重要意义。临床检测抗双链DNA抗体IgG的常见方法有间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、酶促化学发光法，但这些方法都存在着一些不足。临床检测抗双链DNA抗体IgG的主要方法为酶联免疫吸附法，但该方法存在着下述的不足之处：（1）使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96孔专用微孔板作为抗原包被用具和反应容器，在使用时只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，无法进行独立的、单人份的检测；（2）定量测定所用的试剂种类较多，每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装，并且每使用一种试剂时都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中，不但试剂瓶种类多，加注试剂的操作也极为繁琐；（3）缺少对检测信息的相应标注，只能通过查看试剂盒外包装盒的标识才能了解或知悉检测试剂的生产批号及有效期信息，而且所知悉的信息在检测过程中不受控，具有很大的随意性；（4）检测试剂在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果的准确性；（5）检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复杂，容易发生操作差错，检测结果的准确度和精密度较差；（6）在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数×48/96人份，如果需要检测10个项目，则试剂的配置及使用数须为10×48/96人份，如果只有一份样本需要检测10个不同的项目，也需要配置10×48/96人份的试剂，存在着不够经济合理的缺点。
技术实现思路
目前抗双链DNA抗体IgG检测技术存在以下缺点：检测成本高、检测灵敏度低、检测线性范围窄、重现性低、不能定量、操作复杂等。本专利技术正是为了克服以上所述缺点，公开了一种检测成本低、灵敏度高、检测线性范围广、重现性高、可以定量、操作简单的抗双链DNA抗体IgG试剂盒及其制备方法。本专利技术首先制备化学发光免疫分析试剂盒，主要包括：抗双链DNA抗体IgG单克隆抗体包被的磁颗粒、抗双链DNA抗体IgG单克隆抗体包被的吖啶酯以及抗双链DNA抗体IgG定标品；然后利用全自动化学发光免疫分析仪对定标品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件，测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度；最后对抗双链DNA抗体IgG全自动化学发光免疫分析系统进行性能（灵敏度、线性、精密度、干扰性）的评价。本专利技术与目前技术相比，具有以下优点：1、本专利技术选择吖啶酯作为标记材料，并应用于化学发光免疫分析系统，该发光体系为直接化学发光，与传统的酶促化学发光相比，该反应不需要酶的参与，更加节约成本；2、本专利技术选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统检测灵敏度高，能够达到2.0IU/mL；3、本专利技术选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统线性范围宽，能达到2-300IU/mL；4、本专利技术选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高，批内及批间差均在5%以内，这是其它化学发光免疫分析系统难以达到的；5、本专利技术的化学发光免疫分析系统已实现样本的定量，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本就可直接得到样本的浓度值；6、本专利技术的化学发光免疫分析系统已实现全自动化，试剂及样本的添加全有仪器完成，操作更加简便，减少了人为的误差。附图说明图1为实施例3得到的抗dsDNA抗体IgG标准曲线图。具体实施方式实施例1：抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒制备方法（1）抗双链DNA抗体IgG单克隆抗体包被的纳米磁珠制备：取50mg羧基化的磁微粒（粒径为0.05-1um）悬浮液，磁分离去上清，用0.02M，pH为5.5MES缓冲液重悬，加入0.5-2mL新配置的10mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3-5mg抗双链DNA抗体IgG单克隆抗体，室温下混悬2-10h，磁分离，去除上清，用含2%BSA的0.1MpH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到抗双链DNA抗体IgG单克隆抗体包被的磁颗粒，每瓶5mL分装保存于4℃备用。（2）抗双链DNA抗体IgG衍生物标记的吖啶酯的制备：取50uL25mg/mL的抗双链DNA抗体IgG衍生物，加入150uL0.1-0.2MpH9.0-9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1-2uL5mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1-2h后取出，用2mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的抗双链DNA抗体IgG衍生物标记的吖啶酯溶液，收集离心管中的液体至保存管得到抗双链DNA抗体IgG衍生物标记的吖啶酯，每瓶5mL分装保存于4℃备用。（3）抗双链DNA抗体IgG定标品的制备：用标准品缓冲液（40mMTris-HCl，0.5%BSA，1%NaCl，pH8.0）将抗双链DNA抗体IgG配置成浓度为0IU/mL、20IU/mL、40IU/mL、80IU/mL、160IU/mL、320IU/mL，每瓶0.5mL分装冻干，4℃保存备用。(4)化学发光预激发液的配制：量取1.0升纯化水，依次加入80uL质量分数为20%的双氧水(H2O2)、1.0克叠氮化钠、1.5克吐温20，摇匀后避光存放。(5)化学发光激发液的配制：量取1.0升纯化水，依次加入0.6克氢氧化钠、0.5克PC300、0.5g叠氮化钠、1.5克TritonX-405，摇匀后避光存放。实施例2：抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫检测方法：本专利技术以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，本专利技术的方法学模式为竞争法，即仪器依次加入20uL的样品、50uL的抗双链DNA抗体IgG单克隆抗体包被的磁颗粒以及50uL的抗双链DNA抗体IgG包被的吖啶酯，反应10min后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入50uL化学发光预激发液、50uL化学发光激发液进行发光反应，最后记录发光强度，从标准曲线计算出被测样品的抗双链DNA抗体IgG含量。实施例3：抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒性能评价检测曲线见附图1。灵敏度的检测：参照CLSIEP17-A文件推荐实验方案，计算抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫层析试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度为2.0IU/mL。线性的检测：对浓度为0IU/mL、20IU/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒，所述试剂盒包括：生物素化的双链DNA抗原、链亲和素包被的纳米磁微球、吖啶酯标记的鼠抗人IgG单克隆抗体、化学发光标记物、化学发光底物液、抗双链DNA抗体IgG定标品。

【技术特征摘要】
1.一种抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒，所述试剂盒包括：生物素化的双链DNA抗原、链亲和素包被的纳米磁微球、吖啶酯标记的鼠抗人IgG单克隆抗体、化学发光标记物、化学发光底物液、抗双链DNA抗体IgG定标品。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素化的双链DNA抗原。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述链亲和素包被的包被的固相载体为羧基化的粒径为0.05-1um磁微粒。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物为吖啶酯、吖啶酯磺酰胺、吖啶酯甲苯磺酰胺、吖啶酯对甲基磺酰胺、吖啶酯三氟甲基磺酰胺。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物优选吖啶酯。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液包括化学发光激发液、化学发光预激发液。7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光预激发液为质量分数0.005%~0.5%的双氧水(H2O2)溶液，激发液为0.005mol/L~0.025mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液。8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗双链DNA抗体IgG定标品为用标准品缓冲液将抗双链DNA抗体IgG配制成浓度为0IU/mL、20IU/mL、40IU/mL、80IU/mL、160IU/mL、320IU/mL，4℃保存备用。9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的制备方法，其特征在于包括生物素化的双链DNA抗原的制备、链亲和素包被的纳米磁微球的制备、吖啶酯标记的鼠抗人IgG单克隆抗体的制备、化学发光底物液的制备、抗双链DNA抗体IgG定标品的制备。10.根据权利要求1和权利要求9所述试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）链亲和素包被的磁微粒的制备：取羧基化的纳米磁珠悬浮液，磁分离去上清，MES缓冲液重悬，加入EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入链亲和素，室温下混悬2-...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝建华，徐向红，夏福臻，钱纯亘，代洪飞，
申请(专利权)人：深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44