一种风疹病毒重组蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种风疹病毒重组蛋白，其特征在于，所述风疹病毒重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术利用基因工程重组技术，在大肠杆菌系统中表达风疹病毒主要抗原融合蛋白，具有生产周期短，产量高，成本低，特异性好的优点。本发明专利技术的重组蛋白可做为风疹病毒免疫诊断试剂盒的一部分。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及基因工程领域，特别是一种在大肠杆菌系统中表达重组风疹病毒抗原 的融合蛋白及其应用和生产方法。
技术介绍
孕妇在怀孕早期感染风疹病毒（rubellavirus，RV)，其严重性可引起胎儿的先天 性风疹综合征（eongenitMrubellasyn化ome，CRS)，致使胎儿先天性致崎。不仅如此，儿 童和青少年感染风疹病毒，虽可治愈，但亦可引起如风疹病毒进行性脑炎等罕见的并发症。 而且经流行病学统计，儿童和青少年感染风疹病毒常能引起局部的爆发流行。因此，对孕妇 及易感人群等及时进行风疹病毒感染筛查，不仅对提高人口素质，加快优生计划的进一步 实施，也对提高成人生殖健康，预防后天感染等具有现实意义。 现阶段国内外开展的风疹病毒筛查的主要方法为化ISA检测血清中特异性IgM抗 体，但风疹病毒ELISA试剂盒所使用的抗原多为细胞培养抗原，其来源受到制约，而且纯度 不高，容易造成检测结果的灵敏度及特异性不高。风疹病毒结构蛋白的E1糖蛋白含有T、B 淋己细胞抗原表位，是RV表面的主要祀抗原，也是研制疫苗的理想祀蛋白。目前大多生产 原料公司在风疹病毒重组抗原中所取片段仅为E1，存在诸多方面的缺点，极容易造成最终 诊断产品的假阳性和漏检现象。 尽管大多数中和抗体结合表位位于E1蛋白，但事实上可能很多新近感染RV的病 人也会产生抗另外的病毒蛋白成份。因此重组蛋白用于RV感染诊断具有很大潜力。 本专利技术旨在针对风疹病毒融合抗原进行重组表达，W期用次抗原做为检测风疹病 毒抗体的核屯、原料。 体外诊断核屯、原料的开发则是开发相应诊断试剂的先决条件，只有开发出具有高 活性，高性能的抗原抗体，体外诊断试剂产品才能成为现实。因此，针对风疹病毒抗原开发 出能够用W生产诊断试剂的原料迫在眉睫。从某种程度上说，原料的开发也必将成为降低 风疹病毒感染首要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种风疹病毒抗原的重组蛋白，此重组蛋白是利用基因工程 重组技术，在大肠杆菌系统中表达的重组风疹病毒抗原，具有生产周期短，产量高，成本低 的优点。本专利技术的风疹病毒的融合蛋白可做为风疹病毒免疫诊断试剂盒的一部分。[000引一种风疹病毒重组蛋白，其特征在于，所述风疹病毒重组蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO. 1 所示。 沈QIDNO. 1 ;PLLATSSTLTRPPGSSSIQRPGPSGNGSRFANAI化TARGLWGPRQSV。 本专利技术的另一个目的在于提供上述风疹病毒重组蛋白在制备风疹病毒抗体检测 试剂盒中的应用。 本专利技术还提供了编码SEQIDNO. 1的风疹病毒重组蛋白基因，其核巧酸序列如SEQ IDNO. 2 所示。 沈QIDNO. 2;CCCTTGCTAGCTACGTCCAGCACCCTCACAAGACCGCCCGGGTCAAGTTCCATACAG AGACCAGGACCGTCTGGCAACGGATCCCGGTTTGCCAACGCCATTCCCCTGACTGCTCGCGGCTTGTGGGGGCCACG CCAGAGCGTC。 本专利技术的第=个目的是提供含有风疹病毒重组蛋白基因的重组载体，其特征在 于，在质粒pMa^c2x中包含有SEQ ID NO. 2核巧酸序列。 本专利技术最后一个目的在于提供了上述重组载体的蛋白表达方法，其特征在于，其 表达时的诱导温度在37度，诱导转速为2(K)巧m，诱导的IPTG浓度为ImM。 本专利技术重组蛋白基因由人工合成。所用的载体为pMa^c2x，为氨节抗性，融合表达 麦芽糖结合蛋白MBP，蛋白定位于细胞周质。 本专利技术的表达系统为大肠杆菌化21表达系统，它具有周期短，费用低，表达量大 等特点。 为了使得重组蛋白更好的保持活性位点，本专利技术选择比较温和的培养和诱导条 件，其表达时的诱导温度在37度，诱导转速为2(K)巧m，诱导的IPTG浓度为0. 3mM。该样使 得重组蛋白有了更加缓慢的表达，有充分的时间进行空间构象的形成。 本专利技术可W采用超声的方式破碎细菌。在破碎菌体的时候，为了避免太过剧烈，将 破碎条件定为200W，超声3s，间隔6s超声一次，共180次。 本专利技术重组蛋白的纯化方式可W有多种，例如离子交换层析，凝胶过滤层析和亲 和层析等方法。本专利技术优选亲和层析，因为重组蛋白中本专利技术加入了MBP标签，一步纯化能 够达到较高的纯度。 本专利技术对风疹病毒抗原表位进行重组表达，该样就既保留了E1的主要抗原决定 簇位，进而有效的避免了假阴性即漏检现象，同时也去掉了一些非决定簇序列，提高产品稳 定性，降低产品假阳性风险。【具体实施方式】 实施例1含有风疹病毒重组基因表达载体的构建[002引 由上海捷瑞生物工程有限公司合成重组基因序列SEQIDNO. 2,载体为pMa^c2x。沈QIDNO. 2;CCCTTGCTAGCTACGTCCAGCACCCTCACAAGACCGCCCGGGTCAAGTTCCATACAG AGACCAGGACCGTCTGGCAACGGATCCCGGTTTGCCAACGCCATTCCCCTGACTGCTCGCGGCTTGTGGGGGCCACG CCAGAGCGTC。 实施例2含有风疹病毒重组蛋白的表达 将合成好的风疹病毒重组蛋白质粒转化至大肠杆菌化21中，涂布于含lOOug/ml 氨节青霉素（sigma,货号；A9518)的LB平板上，37度过夜培养，挑取单克隆菌落，用含有相 同浓度的氨节青霉素的300mlLB培养基37度培养至0D600达0. 6左右，用终浓度为0. 3mM 的IPTG(上海生工，货号JB0168)进行诱导表达，诱导条件为；37度，转速2(K)巧m，化。诱 导之后，将培养液4度，转速7000巧m，离屯、lOmin，收集菌体。 实施例3含有风疹病毒重组蛋白的纯化及复性用 50ml上样缓冲液BindingBuffer(50mMTris，0. 5MNacl，lmMEDTA， p服.0) 50ml破碎菌体，然后超声破碎，条件为200w，超声3s，间隔6s，共180次，最后 12000巧m，30min，4度离屯、收集上清，目的蛋白在上清中。接着过Amylose柱一步纯化，用洗 脱缓冲液ElutionBuffer(50mMTris，0.5M化cl，lmM邸TA，10mMMaltose,P服.0)洗脱目 的蛋白。将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液巧OmMTris，0. 5M化cl，lmM邸TA，p服.0)透 析，每隔1化换一次透析液，共3次。取出透析后的蛋白液，经0. 22um滤器过滤后，用lowry 法测定浓度后，于-20度保存备用。[002引实施例4本专利技术的风疹病毒重组蛋白作为风疹病毒诊断试剂的免疫反应性 4. 1风疹病毒重组蛋白-HRP复合物的制备按照pierce EZ-link plus activated peroxidase kit(货号 31489)进行操作。 4. 2特异性 1000份风疹阴性血清分别每孔50ul包被酶标板，4°C过夜后（大于8小时），用 PBST(10mMPB，150Mm化C1，0. 05%tween20,抑7. 4)洗板 3 次，然后用 1%BSA封闭，4°C 过夜（大于8小时），甩掉封闭液，拍干板子。每孔加入用PBST稀释的风疹病毒重组蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种风疹病毒重组蛋白，其特征在于，所述风疹病毒重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：阮美丽，高飞，陈东，
申请(专利权)人：杭州奥泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33