利用红花悬浮细胞生产CD20抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用红花悬浮细胞系统生产CD20单链抗体的方法。本发明专利技术按照植物偏好性密码子，人工合成CD20单链抗体基因，将其连接到含有35S启动子的植物表达载体pBasta上，采用农杆菌介导的方法转化红花愈伤组织，筛选出具有抗性的愈伤组织然后进行悬浮细胞培养，最后获得大量悬浮细胞，提取蛋白进行纯化并检测，结果表明，利用红花悬浮细胞表达的CD20抗体的活性高于利用拟南芥种子系统表达的抗体活性，利用红花悬浮系统表达突变后的TK‑CD20活性明显高于原有序列的表达活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物领域，具体的说是利用红花悬浮细胞系统表达CD20单链抗体的方法。
技术介绍
植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。近年来，植物悬浮细胞表达系统已成为有前途的替代传统的微生物发酵和哺乳动物细胞的生物反应器，其特点在于：⑴细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；⑵可以提供大量较为均匀的细胞；⑶内源蛋白水解酶活性低；⑷可以进行稳定表达和瞬时表达；⑸蛋白表达稳定性高；⑹具有蛋白翻译后修饰的能力及产品能够工业化生产。自1993年来，关于植物悬浮细胞表达系统的研究专利，我国仅有相关研究专利5篇，且从2006年才开始申报。而国外在1993年就已经有水稻原生质体悬浮细胞表达蛋白的专利出现，在专利申报方面国内与国外存在较大的差距。CD20是一种磷酸化蛋白质分子,分子质量约为53kD,属于4次跨膜的蛋白质超家族,为B淋巴细胞表面特有的分化抗原。CD20分子具有不易脱落、与抗体结合后不内化、在人体血清中无游离形式存在等特征，因此作为治疗B细胞淋巴瘤的理想作用靶点受到了人们的关注。目前，关于CD20的抗体药物陆续被批准上市，且价格越来越昂贵，生产成本较高。大肠杆菌表达系统是单链抗体最常用的原核表达系统，很多单链抗体的研究均选择此表达系统。然而大肠杆菌是原核生物，普遍认为，其表达产物缺乏糖基化等加工修饰而在人体内稳定性较差易被降解。另外，大肠杆菌表达系统中的有热原质（pyrogen），生物制品或注射液除去热原质比较困难。本项目拟建立植物（红花）的悬浮细胞表达体系，利用植物悬浮细胞系统来表达具有重要生物活性的CD20单链抗体药物，为推动我国抗体药物市场的发展开辟新的生产途径。本专利技术的目的是为了解决大肠杆菌表达系统中表达产物缺乏糖基化等加工修饰而在人体内稳定性较差易被降解、存在热原质问题，提高CD20单链抗体的活，而提供一种CD20单链抗体基因及利用红花悬浮细胞系统表达CD20单链抗体的方法。一种CD20单链抗体基因，它的碱基序列如SEQIDNO.2所示。重组植物表达载体pBasta-LPH-CD20，将序列表SEQIDNO.2所示的基因插入了植物表达载体pBasta。利用红花悬浮细胞系统表达CD20单链抗体的方法,它包括：1）重组质粒pBasta-LPH-CD20转化到感受态农杆菌中；所述的重组质粒pBasta-LPH-CD20，是在植物表达载体pBasta插入了序列表SEQIDNO.1或2所示的基因；2）农杆菌侵染外植体，所述的外植体为红花叶片；3)转入共培养培养基共培养；2mg/LNAA+0.5mg/L6-BA的MS培养基4)转到愈伤继代培养基中抑菌培养；5）诱导分化出愈伤组织接种到进行继代培养。6）获得愈伤组织后进行液体摇瓶培养，继代三次后获得悬浮细胞，将获得的悬浮细胞进行蛋白提取；步骤3所述的培养基为2mg/LNAA+0.5mg/L6-BA的MS培养基；步骤4所述的培养基为2mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+100mg/L头孢霉素+100mg/L卡那霉素的MS培养基；步骤5所述的培养基为1mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+100mg/L头孢霉素+100mg/L卡那霉素的MS培养基。本专利技术提供一种利用红花悬浮细胞系统生产CD20单链抗体的方法。本专利技术按照植物偏好性密码子，人工合成CD20单链抗体基因，将其连接到含有35S启动子的植物表达载体pBasta上，采用农杆菌介导的方法转化红花愈伤组织，筛选出具有抗性的愈伤组织然后进行悬浮细胞培养，最后获得大量悬浮细胞，提取蛋白进行纯化并检测，结果表明，利用红花悬浮细胞表达的CD20抗体的活性高于利用拟南芥种子系统表达的抗体活性，利用红花悬浮系统表达突变后的TK-CD20活性明显高于原有序列的表达活性。附图说明附图1CD20基因的PCR扩增结果；附图2pEASY-T1-CD20的PCR鉴定结果；附图3pBasta-LPH-CD20双酶切鉴定结果；附图4pBasta-LPH-CD20的农杆菌菌液PCR检测；附图5红花悬浮细胞体系鉴定结果；附图6pBasta-LPH-CD20转基因红花悬浮细胞Westernblot检测；附图7利用外周血单核淋巴细胞对CD20的活性检测结果；附图8利用Fv区突变体对CD20的活性检测结果。具体实施方式实施例1CD20单链抗体基因重组植物表达载体的构建1、CD20单链抗体基因的获得人工合成CD20单链抗体基因，设计序列时将其优化为植物偏好型密码子，基因由生物公司合成，其碱基序列如SEQIDNO.1所示。设计上游含Xmal酶切位点（CCCGGG）和下游含EcoRI的酶切位点（GAATTC）的引物。上游引物CD20F：AATACCCGGGATGGCCCACGCCCGCGTCCTC下游引物CD20R：AATAGAATTCTTATTTACCAGGTGACAATGA以人工合成的基因为模板，采用上述引物对其进行常规PCR扩增，获得了全长为1482bp的目的基因，如图1所示。2、目的基因的克隆采用常规重组克隆载体构建技术，将上述目的基因的PCR产物与克隆载体pEASY-T1连接，构建pEASY-T1-CD20，并转化大肠杆菌感受态DH5α，经卡那霉素筛选阳性克隆子后，对其进行菌体扩增培养。待菌液OD600为0.6-0.8时，收获菌液，试剂盒提取质粒，采用PCR初步鉴定，如图2所示，获得了与预期大小相符的条带。将该重组克隆质粒送往上海生工生物工程公司测序，结果表明，成功获得了优化密码子之后的CD20基因。3、重组植物表达载体pBasta-LPH-CD20的构建采用Xmal和EcoRI限制性内切酶，分别对pEASY-T1-CD20和pBasta进行双酶切，试剂盒回收CD20基因和pBasta载体大片段，采用T4DNA连接酶对其进行连接。连接产物转化转化大肠杆菌感受态DH5α，筛选阳性克隆子进行增菌培养，提取质粒，进行Xmal和EcoRI双酶切鉴定。如图3所示，在预期大小位置可见条带，表明成功构建了重组植物表达载体pBasta-LPH-CD20。实施例2重组农杆菌的获得采用常规农杆菌转化方法，将实施例1所述的重组质粒pBasta-LPH-CD20转化到农杆菌EHA105感受态中，过夜培养，挑取单菌落，进行菌液PCR验证，结果再预期位置可见清晰条带，表明成功获得了携带pBasta-LPH-CD20ab的重组农杆菌。实施例3红花悬浮细胞体系的建立利用云红一号红花品种，叶片作为外植体，建立红花的最佳悬浮细胞体系，种子培养基以MS为基本培养基。最佳愈伤诱导培养基为MS+2mg/LNAA+0.5mg/L6-BA（如图5A所示），最佳愈伤继代培养基为MS+1mg/L的NAA+0.5mg/L6-BA（如图图5B所示），最佳液体悬浮培养基为不加琼脂粉的MS+1mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+600mg/LCH（如图5C所示）。每100mL的三角瓶中加入液体悬浮培养基50mL,摇床转速为120r/min,温度为25℃,黑暗培养。实施例4构建稳定表达CD20单链抗体的红花悬浮细胞系1、pBasta-LPH-CD20重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CD20单链抗体基因，它的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种CD20单链抗体基因，它的碱基序列如SEQIDNO.2所示。2.重组植物表达载体pBasta-LPH-CD20，将序列表SEQIDNO.2所示的基因插入了植物表达载体pBasta。3.利用红花悬浮细胞系统表达CD20单链抗体的方法，它包括：1）重组质粒pBasta-LPH-CD20转化到感受态农杆菌中；所述的重组质粒pBasta-LPH-CD20，是在植物表达载体pBasta插入了序列表SEQIDNO.1或2所示的基因；2）农杆菌侵染外植体，所述的外植体为红花叶片；3)转入共培养培养基共培养；4)转到愈伤继代培养基中，抑菌培养；5）诱导分化出愈伤组织接种到进行继代培养；6）获得愈伤组织后进行液体摇瓶培养，继代三次后获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜潮，李校堃，李海燕，刘秀明，王立勇，姚娜，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22