本发明专利技术提供了一种用于检测EB病毒Rta/IgG抗体的化学发光试剂盒及其应用，属于生物技术、医学免疫学与体外血清学诊断技术领域。所述化学发光试剂盒包括包被有抗His标签单抗的磁颗粒，携带His标签的Rta蛋白，携带His标签的特异性人工多肽及吖啶酯标记的抗人IgG抗体；所述特异性人工多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术还提供了基于所述化学发光试剂盒的检测EB病毒Rta/IgG抗体的方法。采用本发明专利技术所述的化学发光试剂盒及检测方法能够快速、准确、高效、灵敏、特异地检出待测样品中存在的EB病毒Rta蛋白抗体，同时能实现多样本处理，缩短了检测时间，提高了检测效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术、医学免疫学与体外血清学诊断
，具体涉及用于检 测EB病毒Rta/IgG抗体的化学发光试剂盒及其应用。
技术介绍
鼻咽癌是指发生在鼻腔与咽之间鼻咽部的恶性肿瘤，占头颈部恶性肿瘤的 78.08%，占上呼吸道癌肿的92. 99%。鼻咽癌好发年龄在35至50岁之壮年期，占发病人数 60%，易对社会、经济、劳力及家庭造成重大冲击，危害性很大。 经多年研究发现，鼻咽癌与EB病毒关系最为密切，EB病毒被激活感染鼻咽部细 胞，由潜伏期进入裂解复制状态时，导致鼻咽部细胞发生异常分裂增生造成癌变。鼻咽癌患 者血清中具有针对多种EB病毒抗原的抗体谱，一般通过检测血清EB病毒抗体来评估患鼻 咽癌的危险度，为鼻咽癌的诊断提供了有效的检测指标。申请号为200610113403的专利技术专 利申请公开了 Rta是EB病毒刚刚进入裂解复制状态时就表达的立即早期基因 BRLFl的编 码转录激活蛋白，是EB病毒进入裂解复制状态必需的激活元件而且仅在鼻咽癌发生时表 达，对诊断鼻咽癌具有较高的灵敏度和特异性。 在酶联免疫领域，同昕生物技术（北京）有限公司的研究人员构建了针对EB病 毒BRLFl基因的原核表达系统，通过大肠杆菌表达出EB病毒Rta蛋白，并利用表达的Rta 蛋白建立了临床用于鼻咽癌筛查、早期诊断和疗效监控的ELISA试剂盒（专利【申请号】 200610113403.2)。为提高包被抗原的生物活性，同昕生物技术（北京）有限公司研究人 员成功建立了高效稳定表达EB病毒Rta蛋白的重组CHO细胞株CH0/RTA(其保藏号为： GMCC6955,专利号为：201210534965. X)，并利用其表达纯化蛋白建立了定量检测EB病毒 Rta-IgG抗体的酶标板及ELISA试剂盒（专利号为：201210533496. X)。 在快速诊断领域，同昕生物技术（北京）有限公司的研究人员经过研究，将鼻咽癌 标志抗原Rta和VCA抗原应用于胶体金免疫平台上，成功建立了鼻咽癌双标记物金标测试 卡（专利【申请号】200920222433. 6)。 尚未见有磁颗粒化学发光免疫分析方法检测EB病毒Rta-IgG抗体的检测试剂盒 的报道。 化学发光免疫分析（CLIA)是继放射免疫分析、酶免疫分析和荧光免疫分析之后 发展起来的一项新的免疫分析技术。大量的实验结果及临床应用资料显示，化学发光免疫 分析技术具有灵敏度高、快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点，成为取代 放射免疫分析和酶联免疫分析技术的首选。鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物是最早使用的一 类化学发光物质，但其应用于化学发光免疫分析，需要使用催化剂及增强剂，这将导致背景 发光增强，使测量本底升高，从而限制了这一技术的灵敏度和它的应用及发展。到1983年 Weeks首次合成了用于化学发光免疫分析的吖啶酯以来，由于吖啶酯具备发光体系简单，不 需要催化剂，在有H2O 2的稀碱性溶液中即能发光，特别是无须一个催化过程，也不需要增强 剂，从而降低了背景发光，提高了灵敏度且干扰作用小。吖啶酯的光释放快速集中，发光峰 值在0. 4s，半衰期为0. 8s，发光效率高且强度大；易于蛋白质联结，且分子量小，对联结后 抗体构象影响小，且标记物稳定性好，已成为国际主流品牌厂家选择的化学发光免疫分析 方法，广泛应用于临床。
技术实现思路
本专利技术针对上述领域空白，提供一种检测EB病毒Rta蛋白抗体IgG的吖啶酯标记 的磁颗粒化学发光检测试剂盒。本试剂盒填补了市场空白，并且经临床实验证明，灵敏度 尚，特异性尚，稳定性好。 本专利技术请求保护的技术方案如下： 用于检测EB病毒Rta/IgG抗体的化学发光试剂盒，其特征在于，包括包被有抗His 标签单抗的磁颗粒，携带His标签的Rta蛋白，携带His标签的特异性人工多肽及吖啶酯标 记的抗人IgG抗体； 所述特异性人工多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 所述Rta蛋白为保藏号CGMCC6955的CHO细胞株CH0/RTA表达所得。 所述化学发光试剂盒还包括EB病毒Rta/IgG校准品、样品稀释液和洗涤液。 所述EB病毒Rta/IgG校准品为含人EBV Rta-IgG的磷酸盐缓冲液； 所述样品稀释液为含0. 3M NaCl的50mM的磷酸盐缓冲液； 所述洗涤液为pH值为L 2~8. 5,包含有Proclin300和吐温-20的0· 01~ 0. 03mol/L的磷酸盐缓冲液，所述Proclin300在所述洗涤液中的终浓度为体积百分比 0. 02~0. 05%，所述吐温-20在所述洗涤液中的终浓度为体积百分比I. 0~2. 0%。 所述化学发光试剂盒在检测EB病毒Rta/IgG抗体方面的应用。 -种检测EB病毒Rta/IgG抗体的方法，其特征在于，进行如下检测步骤： (1)获取标准曲线和曲线方程， 其横坐标为Rta/IgG校准品梯度浓度数值，纵坐标为以梯度浓度的Rta/IgG校准 品进行以下步骤所得的荧光值； (2)在载玻片上依次滴加工作液1、工作液2,孵育、干燥； (3)加入经样品稀释液稀释后的待测样品，孵育、干燥； (4)加入工作液3,孵育、干燥； (5)经洗涤液洗涤后，将载玻片置于荧光显微镜下观察读数； (6)读出的荧光值代入所述标准曲线获得待测样品蛋白浓度。 所述工作液1为包被有抗His标签单抗的磁颗粒溶液； 所述工作液2为携带His标签的Rta蛋白及携带His标签的特异性多肽的混合溶 液； 所述工作液3为吖啶酯标记的抗人IgG抗体溶液； 所述特异性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 所述Rta蛋白为保藏号CGMCC6955的CHO细胞株CH0/RTA表达所得。 所述样品稀释液为含0. 3M NaCl的50mM的磷酸盐缓冲液； 所述洗涤液为pH值为7. 2~8. 5,包含有Proclin300和吐温-20的0. 01~ 0. 03mol/L的磷酸盐缓冲液，所述Proclin300在所述洗涤液中的终浓度为体积百分比 0. 02~0. 05%，所述吐温-20在所述洗涤液中的终浓度为体积百分比1.0 ~2. Ο%。 本专利技术提供的试剂盒，利用抗His标签单抗结合添加了 His标签的抗原，与待测 样品进行反应，再与吖啶酯标记的抗人IgG抗体结合，洗涤后，将结果置于荧光显微镜下观 察，若待测样品中的EB病毒Rta/IgG抗体呈阳性，则出现发光信号；若无发光信号，则待测 样品为EB病毒Rta/IgG抗体阴性。所述添加了 His标签的抗原为添加 His标签的Rta蛋 白和特异性多肽，所述Rta蛋白为保藏号CGMCC6955的CHO细胞株CHO/RTA表达所得；所 述特异性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。所述CHO细胞株CHO/RTA的保藏信息如 下：菌株分类：CH0细胞株，其保藏编号为：CGMCC6955。 为了增加该试剂盒的灵敏度和特异性，本专利技术根据EB病毒Rta蛋白的氨基酸 (Protein Id:CAA24813.1)序列（GenBank:V01555.2)设计出高特异性多肽，如 SEQ ID NO: 1所示，该片段是抗原表位比较集中且不影响蛋白空间结构的片段拼接而得，其与Rta 蛋白混合后作为反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测EB病毒Rta/IgG抗体的化学发光试剂盒，其特征在于，包括包被有抗His标签单抗的磁颗粒，携带His标签的Rta蛋白，携带His标签的特异性人工多肽及吖啶酯标记的抗人IgG抗体；所述特异性人工多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴凡，卢晓希，焦守恕，李全，
申请(专利权)人：同昕生物技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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