本发明专利技术属于分子生物学领域，涉及一种边界病病毒（BDV）重组E2蛋白及其IgG抗体检测试剂盒。系将BDVE2蛋白主要抗原区域克隆入原核表达载体得到重组表达载体，将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，经重组大肠杆菌表达纯化后获得重组BDVE2蛋白，Westernblot试验证明该蛋白具有良好的抗原性。将该蛋白包被酶标板，通过抗原包被浓度、血清稀释度和作用时间、二抗浓度和作用时间以及显色时间的优化建立ELISA方法，检测山羊BDV阴性血清确定临界值和判定标准。本发明专利技术构建的重组菌株对外源蛋白表达稳定，抗原性好；在此基础上首次用于建立边界病病毒IgG抗体ELISA检测方法。
【技术实现步骤摘要】
边界病病毒重组E2蛋白及其IgG抗体检测试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种边界病病毒重组E2蛋白和边界病病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒。
技术介绍
大肠杆菌表达系统是目前比较成熟的表达系统，具有操作简单，安全无毒，外源蛋白表达量高等优点，已经成功用于多种蛋白的生产。E2蛋白是边界病病毒(Border diseasevirus, BDV)的主要囊膜蛋白，介导病毒感染入胞和保护性免疫反应，是BDV主要的免疫保护性抗原。目前国际普遍采用的边界病病毒抗体的检测方法主要基于全病毒建立间接ELISA方法和中和实验，国内尚无研究报道，此外对于该蛋白诱导IgG抗体产生规律的研究尚未进行，本专利技术旨在建立检测边界病E2蛋白IgG抗体的ELISA方法，为临床检测和相关研究奠定基础。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目 的是针对目前尚无BDV IgG抗体检测方法的现状，提供一种准确可靠的BDV IgG抗体ELISA检测试剂盒。本专利技术的另一目的是提供用于ELISA方法的重组E2蛋白的制备方法。技术方案本专利技术的目的通过如下技术方案实现:一种边界病病毒重组E2蛋白，该蛋白系将包含E2主要抗原区的基因片段克隆入原核表达载体得到重组表达载体，将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)，该重组大肠杆菌BL21 (DE3)培养至OD6tltl达0.6-0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，分离菌体经Ni亲和层析柱纯化获得。所述边界病病毒BDV重组E2蛋白氨基酸序列为SEQ ID N0.1，即边界病病毒(毒株JSLS12-01为参考毒株)的多聚蛋白第793-1002位氨基酸残基:CPCDSKPVVKGKFNTTLLNGNAFQLVCPLGWVGQVECTTVSTTTLAVEVVKTYKRSKPFPRRAGCDHTTISGEDLYHCTMG GNWTCIKGEQVRYAGGAVKQCKWCDFIFREKAGLTHYPIGKCILNNETGYRYVDDTPCEKGGVAISKTGNLECLIGETVVK VFSTDERLGPMPCRPKEVISSEGPISKTACTFNYSKTLKNKYYEPRDS其核苷酸序列为SEQ ID N0.2。TGTCCTTGTGATTCCAAACCCGTGGTTAAGGGTAAATTCAATACAACACTGCTCAACGGGAATGCATTCCAGTTAGT CTGCCCTCTAGGGTGGGTAGGACAAGTGGAGTGTACCACCGTGAGCACCACCACTTTAGCCGTTGAAGTGGTGAAAACATA TAAAAGGAGCAAACCATTCCCCCGAAGAGCTGGCTGTGACCACACCACCATTTCTGGAGAAGACCTGTATCACTGCACGAT GGGTGGCAACTGGACTTGCATTAAAGGTGAACAAGTGAGGTACGCTGGGGGTGCAGTTAAGCAGTGCAAGTGGTGTGACTT CATATTTAGAGAAAAAGCTGGTCTTACTCACTACCCAATAGGCAAGTGCATTTTAAATAATGAGACAGGTTACAGGTATGT AGATGACACACCATGTGAAAAGGGTGGGGTGGCGATTAGTAAGACCGGGAATCTAGAGTGCTTGATAGGGGAAACCGTGGT GAAGGTGTTTAGCACGGATGAGAGGTTAGGACCTATGCCTTGCAGGCCGAAGGAAGTGATATCTAGTGAGGGGCCCATCAG TAAGACCGCCTGCACTTTCAACTATTCAAAAACCCTCAAGAACAAATACTATGAACCTAGGGATAGT所述的原核表达载体为pET32a。本专利技术所述的重组大肠杆菌表达的BDV E2蛋白的制备方法，包括如下步骤:(I)根据 BDV JSLS12-01 株基因序列设计引物 F:CGGGATCCTGTCCTTGTGATTCCAAGCC(SEQ ID N0.3)、R:CCCTCGAGACTATCCCTAGGTTCATAGTA (SEQ ID N0.4)，从 BDV JSLS12-01 株病毒中提取RNA，经RT-PCR扩增得到编码目的基因片段(目的基因片段为SEQ ID N0.2，不包含酶切位点和保护性碱基)，通过BamH I和Xho I两个酶切位点，把所述的基因片段克隆入原核表达载体中，然后通过酶切和测序鉴定，获得阳性重组质粒；(2)将步骤(1)所述的经序列测定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得到重组表达菌株BL21-E2 ；(3)培养所述的重组表达菌株BL21-E2，加入IPTG进行诱导表达，经亲和柱纯化获得所述的重组蛋白。用所述的边界病病毒重组E2蛋白作为抗原建立检测边界病病毒特异性IgG抗体的ELISA检测方法并组装成试剂盒，系将上述重组蛋白包被酶标板，通过抗原包被浓度、血清稀释度和作用时间、二抗浓度和作用时间以及显色时间的优化建立ELISA方法，检测阴性血清确定临界值和判定标准。有益效果:目前使用的BDV抗体检测方法大多用瑞典Svanova公司以重组全病毒为抗原检测IgG抗体的ELISA方法，国内没有相关检测试剂盒。本专利技术构建了表达BDVE2蛋白的重组大肠杆菌，并将其用于建立BDV IgG抗体ELISA检测方法，初步应用结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性；该试剂盒检测与边界病病毒同属的猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒阳性血清均为阴性，特异性良好；将阳性血清和阴性血清连续倍比稀释，计算P/N值，直到1/1600仍为阳性，证明该方法具有很高的敏感性；经检测批内变异系数〈4%，批间变异系数〈10%，证明本方法具有良好的重复性。这将为系统研究BDV感染后IgG抗体产生规律、临床感染情况的监测和诊断方法的建立奠定基础。【附图说明】[0021 ] 图1目的基因的PCR扩增。E2:PCR 产物；M:DNA marker DL-2000图2重组质粒的酶切鉴定M:DNA marker DL-2000 ；1:酶切的重组质粒；2:空质粒对照图3 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达与纯化M:蛋白Marker ；1:空载体诱导产物；2:纯化后包涵体图4重组蛋白的Western blot鉴定I:H IS单抗鉴定空载体诱导产物；2 =HIS单抗鉴定重组BDV-E2蛋白；3:BDV阳性山羊血清鉴定重组BDV-E2蛋白【具体实施方式】 实施例1E2基因片段的PCR扩增与原核表达质粒的构建1.1引物设计根据根据CSFV基因序列设计引物，上下游引物各引入BamH I和Xho I位点，序列如下:F:CGGGATCCTGTCCTTGTGATTCCAAGC (SEQ ID N0.3)；R:CCCTCGAGACTATCCCTAGGTTCATAGTA (SEQ ID N0.4)以上引物由南京思普金生物科技有限公司合成。1.2PCR扩增目的片段取200 μ I BDV JSLS12-01 毒株(见参考文献 Liu X, Mao L, Li W，Yang L, ZhangW，Wei J, Ji ang J.2013.Genome Sequence of本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种边界病病毒重组E2蛋白，该蛋白系将包含E2主要抗原区的基因片段克隆入原核表达载体pET‑32a得到重组表达载体，将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，该重组大肠杆菌BL21(DE3)培养至OD600达0.6‑0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，分离菌体经Ni亲和层析柱纯化获得。
【技术特征摘要】
1.一种边界病病毒重组E2蛋白，该蛋白系将包含E2主要抗原区的基因片段克隆入原核表达载体pET-32a得到重组表达载体，将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)，该重组大肠杆菌BL21 (DE3)培养至0D_达0.6-0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，分离菌体经Ni亲和层析柱纯化获得。2.根据权利要求1所述的重组E2蛋白，其氨基酸序列为SEQID N0.1。3.根据权利要求1或2所述的重组E2蛋白，其特征在于，编码该蛋白的核苷酸序列为SEQ ID N0.2。4.权利要求1-3之一所述的边界病病毒BDV重组E2蛋白的制备方法，包括如下步骤: (1)根据边界病病毒基因序列设计引物F:CGGGATCCTGTCCTTGTGATTCCAAG...
【专利技术属性】
技术研发人员：毛立，李文良，刘霞，江杰元，杨蕾蕾，张纹纹，邓加武，王钟毓，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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