本发明专利技术涉及检测人巨细胞病毒IgG和IgM的ELISA试剂盒，包括包被抗人γ链、µ链单克隆抗体的酶标板和辣根过氧化物酶标记的重组PP65322‑561蛋白。其中，包被抗人γ链单克隆抗体的酶标板用于检测HCMV IgG抗体，包被抗人µ链单克隆抗体的酶标板用于检测人巨细胞病毒IgM抗体。本发明专利技术试剂具有较好的特异性、敏感性、稳定性和可重复性，且试剂制作过程简单、标准易于控制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测人巨细胞病毒（HCMV）IgG和IgM抗体的ELISA检测试剂盒。
技术介绍
人巨细胞病毒（humancytomegalovirus，HCMV）可通过口腔、生殖道、胎盘、授乳以及输血或器官移植等多途径传播。人群感染HCMV的显著特点是感染率高，正常成人HCMV抗体阳性率为76.7%－95.8%，我国也是HCMV感染高度流行国家之一。HCMV初次感染可无明显症状，但病毒从此长期潜伏体内。当机体免疫功能低下时，潜伏病毒开始复制并大量增殖，继发活动性感染并表现多种临床症状。HCMV感染是导致出生缺陷的重要因素之一，并且有研究显示HCMV感染与糖尿病、动脉粥样硬化及一些恶性肿的发病密切相关。临床活动性HCMV感染多见于孕妇，新生儿、输血患者、恶性肿瘤和艾滋病患者以及器官移植等使用免疫抑制剂的患者。孕妇活动性感染可通过胎盘、产道或授乳传给胎儿，导致流产，死胎，胎儿形态畸形，器官功能障碍。先天感染的新生儿出生时可伴有黄疸、瘀斑、脉络膜视网膜炎、小头畸形等，而无症状的部分新生儿，随着发育才逐渐被发现听觉、视力低下，智力发育迟缓，运动障碍等。在恶性肿瘤、艾滋病、器官移植等免疫功能减弱或受抑制的患者HCMV的活动性感染常并发间质性肺炎、视网膜炎、食管炎、结肠炎和脑膜脑炎等多器官脏器损害的各种临床综合征，是患者致死或移植术失败的重要原因。无论是初次感染还是潜伏病毒的继发活动性感染，病毒大量复制、出现症状的早期机体会产生IgM型抗体。IgM相对于IgG的特点是产生早、消失快。所以IgM的检出代表近期感染、机体可能尚处于病毒大量复制状态。加之IgM的检测多采用简便快速价格低廉的ELISA方法，所以尽管存在被检出的时间段较短，依然是临床常用的初步判断感染与否的检测方法。而目前检测HCMVIgM的试剂多以HCMV全病毒裂解蛋白作为包被抗原。其抗原成分复杂且潜在宿主细胞蛋白污染的可能，也潜在结合疱疹病毒科其他病毒抗体产生假阳性信号的可能，并且试剂的制作过程因需要培养病毒而操作繁琐。少数HCMVIgM抗体检测试剂虽以HCMV的重组蛋白为包被抗原，试剂制作经济简便，但是试剂的稳定性较差，敏感性和特异性也有待提高。所以研制制作过程简单、费用低廉、敏感性和特异性更好的HCMVIgM抗体检测试剂依然具有实际意义。检测IgG抗体了解人群感染率，对HCMV相关疾病的预防、管理控制及相关政策的制定具有重要意义。而明确个体HCMV已感染状态则利于临床确定个体治疗方案，如AIDS及器官移植术患者，需要检测HCMVIgG抗体，从而确定是否需要跟踪其IgM抗体水平，以便及时抗HCMV治疗。所以HCMVIgG抗体的检测虽然只能代表曾感染、体内潜伏有HCMV，并非病毒活动性感染的指证，但是仍然具有市场需求。目前市售检测HCMVIgG抗体的试剂多以HCMV全病毒裂解物作为包被抗原，其抗原成分复杂且潜在宿主细胞蛋白污染的可能，也潜在结合疱疹病毒科其他病毒抗体产生假阳性信号的可能，并且试剂的制作过程因需要培养病毒而操作繁琐。少数HCMVIgG抗体检测试剂则以HCMV的重组蛋白为包被抗原，这种试剂制作经济简便但是试剂的稳定性较差，敏感性和特异性也有待提高，而进口的此类试剂价格过高。综上所述，需要一种制作过程简单、费用低廉、敏感性和特异性更好的HCMVIgG和HCMVIgM抗体检测试剂。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种检测人巨细胞病毒IgG和IgM的ELISA试剂盒，至少具有特异性、敏感性、稳定性更高的特点。根据本专利技术的一个方面，提供了一种检测人巨细胞病毒IgG和IgM的ELISA试剂盒，包括包被抗人γ链、µ链单克隆抗体的酶标板和辣根过氧化物酶标记的重组PP65322-561蛋白（以下简称为HRP-PP65）。包被抗人γ链单克隆抗体的酶标板用于检测HCMVIgG抗体，作为优选的技术方案，所述包被抗人γ链单克隆抗体的酶标板的制备方法是；抗人γ链单克隆抗体稀释后加入酶标板孔中，置4℃12~24小时；弃去孔内液体，PBST洗后拍干，含1%BSA的PBS封闭液37℃封闭，PBST洗涤液洗后拍干。包被抗人µ链单克隆抗体的酶标板用于检测人巨细胞病毒IgM抗体，作为优选的技术方案，所述包被抗人µ链单克隆抗体的酶标板的制备方法是；抗人μ链单克隆抗体稀释后加入酶标板孔中，置4℃12~24小时；弃去孔内液体，PBST洗后拍干，含1%BSA的PBS封闭液37℃封闭，PBST洗涤液洗后拍干。作为优选的技术方案，HRP-PP65的制备方法是采用过碘酸钠酶标方法将原核表达并纯化的PP65322-561蛋白与HRP偶联，包括步骤：将辣根过氧化物酶溶于醋酸盐缓冲液，并加入新鲜配制的过碘酸钠混匀，4oC30min后加入已二醇，室温混匀放置30min；加入PP65322-561蛋白，用1.0mol/LPH9.5的PBS调PH至9.0，4oC偶联12~24小时；加入硼氢化钠还原形成稳定的酶结合蛋白，4℃透析过夜去除铵离子。含HCMV强免疫原性抗原表位的重组蛋白可代替全病毒用于HCMV特异性抗体的检测。HCMVPP65蛋白是HCMV众多结构蛋白中可以特异性激发B细胞、细胞毒性T细胞(CTL)和辅助性T细胞(Th)免疫的主要靶蛋白，不同HCMV病毒株中,HCMVpp65基因高度保守，本专利技术所用PP65332～561片段是富含T细胞表位和B细胞表位的PP65第322到561位氨基酸序列。PP65蛋白是HCMV被膜磷蛋白而非糖基化蛋白，无需真核表达的糖基化和折叠过程，在原核细胞表达就可获得高免疫活性蛋白片段。根据本专利技术的另一方面，提供了一种检测人巨细胞病毒IgG抗体的方法，采用了上述试剂盒。作为优选的技术方案，所述检测人巨细胞病毒IgG抗体的方法包括步骤：加样：封闭液稀释待测血清，加入到包被抗人γ链单克隆抗体的酶标板内，37℃孵育，PBST洗涤后拍干；加酶标抗原：封闭液稀释HRP-PP65，加到反应孔中，37℃孵育，PBST洗涤后拍干；加底物液显色：于各反应孔中加入TMB底物溶液，室温显色；终止反应：于各反应孔中加入终止液，观察结果，并测OD450。本专利技术对HSV-Ⅰ型、HSV-Ⅱ型以及EBVIgG阳性血清的检测结果均为阴性，证实无交叉反应，排除了非特异结合疱疹病毒科其他病毒抗体的可能。本实施例批内变异系数介于2.0%～5.2%，批间变异系数介于3.3%～7.6%，均小于10%，说明检测体系稳定，稳定性和可重复性良好。本专利技术与北京贝尔有限公司HCMV-IgGELISA试剂分别对94份临床疑似HCMV感染血清的检测，均检出45例阳性，阳性率均为47.87%。两种试剂符合率是100%。阳性率显著低于正常人群可能与新生儿样品较多有关。根据本专利技术的另一方面，提供了一种检测人巨细胞病毒IgM抗体的方法，采用了上述试剂盒。作为优选的技术方案，所述的检测人巨细胞病毒IgM抗体的方法包括步骤：加样：封闭液稀释待测血清，加入到包被抗人μ链单克隆抗体的酶标板内，37℃孵育，PBST洗涤后拍干；加酶标抗原：封闭液稀释HRP-PP65，加到反应孔中，37℃孵育，PBST洗涤后拍干；加底物液显色：于各反应孔中加入TMB底物溶液，室温显色；终止反应：于各反应孔中加入终止液，观察结果，并测OD本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测人巨细胞病毒IgG和IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：包括包被抗人γ链、µ链单克隆抗体的酶标板和辣根过氧化物酶标记的重组PP65322‑561蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种检测人巨细胞病毒IgG和IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：包括包被抗人γ链、µ链单克隆抗体的酶标板和辣根过氧化物酶标记的重组PP65322-561蛋白。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述包被抗人γ链单克隆抗体的酶标板的制备方法是：抗人γ链单克隆抗体稀释后加入酶标板孔中，置4℃12~24小时；弃去孔内液体，PBST洗后拍干，含1%BSA的PBS封闭液37℃封闭，PBST洗涤液洗后拍干。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述包被抗人µ链单克隆抗体的酶标板的制备方法是：抗人μ链单克隆抗体稀释后加入酶标板孔中，置4℃12~24小时；弃去孔内液体，PBST洗后拍干，含1%BSA的PBS封闭液37℃封闭，PBST洗涤液洗后拍干。4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于辣根过氧化物酶标记的重组PP65322-561蛋白的制备方法是采用过碘酸钠酶标方法将原核表达并纯化的PP65322-561蛋白与HRP偶联，包括步骤：将辣根过氧化物酶溶于醋酸盐缓冲液，并加入新鲜配制的过碘酸钠混匀，4oC30min后加入已二醇，室温混匀放置30min；加入PP65322-561蛋白，用1.0mol/LPH9.5的PBS调PH至9...
【专利技术属性】
技术研发人员：樊卫平，康慧琳，李娜，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：山西;14
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