本发明专利技术公开一种I型登革病毒KMB17细胞适应株及其制备方法，能将流行的I型登革病毒株适应于人胚肺二倍体细胞KMB17上生长，获得在KMB17细胞上稳定传代且病毒复制能力较强的细胞适应株，经过多次噬斑纯化的方法获得纯度较高的纯化适应株。经对病毒进行系列鉴定，I型登革病毒纯化株保持了较好的抗原性以及原始毒株的基本生物学特性。通过本发明专利技术使I型登革病毒KMB17细胞适应株能够以人胚肺二倍体细胞KMB17为基质，进行I型登革病毒扩增，打破了I型登革病毒宿主细胞的局限性，为加快登革病毒预防性疫苗的研发开拓新的思路，为I型登革病毒灭活和减毒活疫苗的研发奠定了基础，同时也具备大规模生产的可行性。
【技术实现步骤摘要】
I型登革病毒KMB1 7细胞适应株的培育及其制备方法
本专利技术涉及一种病毒株的制备方法，具体涉及I型登革病毒在KMB17细胞上的适应株的分离、筛选、选育、纯化以及培养方法，属于病毒疫苗制造
。
技术介绍
登革病毒经埃及伊蚊和白纹伊蚊等虫媒传播，广泛流行于热带和亚热带国家及地区，可引起登革热、登革出血热及登革出血休克征。依抗原性不同可将登革病毒分为1、1、m、iv四个血清型。近年来，由于全球气候变暖、人口流动频繁等因素，登革热在全世界的发病率提高了近30倍，在过去两年中全球登革热感染人群的数量持续增长。登革热是过去50年间世界上最为严重的传染病之一，已经成为严重的全球公共卫生问题。登革热不仅严重危害人民的健康，而且还为国家和个人带来严重的经济负担。由于还没有可供使用的登革热疫苗用于预防，登革热的防控形式日趋严峻，因此登革热疫苗相关的应用基础研究是一项迫在眉睫的任务。但是由于登革热病毒宿主细胞局限的，所以迄今为止全球仍没有获准上市的登革病毒疫苗，因此登革疫苗研发迫在眉睫。目前最有潜力的传统减毒活疫苗候选株是由泰国沃特瑞德研究所研发的以犬肾细胞和恒河猴胚肺细胞为基质的疫苗，VeiX)细胞也被认为是疫苗开发的候选基质，以人源性细胞制备的登革疫苗候选株还未见报道。因此研究登革病毒在人源性细胞上的适应性对于登革病毒疫苗的研发具有重要意义。现有的灭活和减毒活疫苗，主要以Vero、PDK、PGMK和FrhL等非人源性细胞为基质进行生产的，其残余DNA存在潜在的致病危险，目前普遍认为比较安全且免疫效果好的，仍然是用人源性细胞基质(如KMB17细胞)生产的疫苗，自从Hayflick等首次建立二倍体细胞株后，近三十多年来，人二倍体细胞的研究在国际上有很大的发展，在病毒学，细胞学，遗传学，肿瘤学等方面研究工作中已被广泛的应用，尤其在生产病毒疫苗等方面，提供了安全、实用的良好细胞。而以人源性细胞基质制备的登革疫苗候选株目前尚未见报道。因此，研究登革热病毒在人源性细胞上的适应性，对于登革疫苗的研发具有重要意义。人胚肺二倍体细胞系KMB17为中国医学科学院医学生物学研究所建立、可用于疫苗生产的人源细胞。人胚肺二倍体细胞KMB17用于人用疫苗具有很多优点:无致癌性，且安全性高于其它细胞，易于规模化生产，而且对多种病毒具有广泛的敏感性，用其制备病毒性疫苗，还可克服使用原代细胞时在其培养物中可能存在的各种潜在致病因子的危险，作为人源性细胞基质生产人用疫苗时，引入的外源因子较少，比动物来源的细胞基质具有更好的安全性，是当前病毒性疫苗生产较为理想的细胞基质，且能稳定实现大规模疫苗生产。人胚肺二倍体细胞KMB17，已经成功应用于甲肝疫苗、脊髓灰质炎疫苗的生产，其安全性和细胞稳定性都得到了广泛验证，但目前还没有成功应用于I型登革病毒中国株的报导。本专利技术将近年来流行于我国的I型登革病毒分离株在C6/36细胞上进行扩增和鉴定，随后在KMB17细胞上进行适应性培养，优化及建立了 I型登革病毒在KMB17细胞上培养方法。选育出了能稳定传代且病毒扩增量高的细胞适应株，经噬斑纯化获得毒力较强、纯度较高的纯化株，经鉴定病毒纯化株保持了原始毒株的基本生物学特性，且具有较好的抗原性。通过本专利技术可以证实以KMB17细胞为基质进行登革病毒扩增和疫苗研究具有可行性，打破了登革病毒宿主细胞的单一性、局限性，具备大规模生产的可行性，为研发具有我国地域特色的预防性登革病毒疫苗开拓新的思路，为研发拥有自主知识产权的登革病毒灭活和减毒活疫苗奠定基础，此疫苗的研发将产生巨大的经济价值和社会效益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种I型登革病毒KMB17细胞适应株及其制备方法，为将人胚肺二倍体细胞KMB17应用于I型登革病毒疫苗的生产提供技术支持。本专利技术提供的I型登革病毒KMB17细胞适应株通过下列步骤获得: 1)、按Iml病毒液/瓶的量，将浓度为4.0 MOI的I型登革病毒液接种到生长致密、透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，按1:9的体积比补加下列培养液:MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHC03+l%体积比的体积浓度为3%的L-谷氨酰胺+1%体积比的抗生素，在温度为33土0.5°C，C02体积浓度为5%的环境中恒温培养；培养至第五天时，于相同环境条件下，按3.5%的体积比补加体积浓度为7%的NaHC03，培养9-10天，显微镜下观察细胞出现CPE达++++时，将细胞培养瓶放置_20°C反复冻融3次，收集细胞培养液，于4°C 3500 Xg离心10分钟，收集上清，获得病毒液； 2)、将步骤I)所得病毒液，按Iml病毒液/瓶的量，接种到生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，控制病毒浓度为4.0 Μ0Ι，按1:9的体积比补加下列培养液:MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3. 5%体积比的体积浓度为7%的NaHC03，1%体积比的体积浓度为3%的L-谷氨酰胺，1%体积比的抗生素，在温度为33土0.5V，CO2体积浓度为5%的环境中恒温培养；培养至第五天时，于相同环境条件下，按2%的体积比补加体积浓度为7%的NaHC03，培养9-10天，显微镜下观察细胞出现CPE达++++时，将细胞培养瓶放置_20°C反复冻融3次，收集细胞培养液，于4°C 3500 Xg离心10分钟，收集上清，获得病毒液；如此反复连续传代培养三代以上，直至获得传代稳定的I型登革病毒液； 3)、按Iml病毒液/瓶的量，将步骤2)所得传代稳定的I型登革病毒液，接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，并控制病毒浓度为4.0 Μ0Ι，按I: 9的体积比补加下列培养液:MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHC03+l%体积比的体积浓度为3%的L-谷氨酰胺+1%体积比的抗生素，在温度为35+0.5°C，CO2体积浓度为5%的环境中恒温培养；培养至第三天时，在相同环境条件下，按2%的体积比补加体积浓度为7%的NaHC03，培养7天，显微镜下观察细胞出现CPE时，将细胞培养瓶放置_20°C冻融3次，收集细胞液，4°C 3500 Xg离心10分钟，无菌条件下收集上清，获得病毒液并于-70°C下保存； 4)、将步骤3)获得的病毒液反复冻融2次，于4°C，3500Xg离心分离lOmin，收获上清，得病毒液；将该病毒液按Iml病毒液/瓶的量，接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，按1:9的体积比补加下列培养液:MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHC03+l%体积比的体积浓度为3%的L-谷氨酰胺+1%体积比的抗生素，在温度为35±0.5°C，CO2体积浓度为5%的环境中恒温培养；培养至第三天时，于相同环境条件下，按2%的体积比补加体积浓度为7%的NaHC03，培养7天，显微镜下观察细胞出现CPE时，将细胞培养瓶放置_20°C冻融3次，收集细胞液，40C 3500Xg离心10分钟，无菌条件下收集上清，获得病毒液，如此反复连续传代培养10代以上，至KMB17细胞CPE达++++时，即筛选出能在KMB17上稳定传代增值的I型登本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种I型登革病毒KMB17细胞适应株，其特征在于通过下列步骤获得：1）、按1 ml病毒液/瓶的量，将浓度为4.0 MOI的I型登革病毒液接种到生长致密、透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，按1:9的体积比补加下列培养液： MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHCO3+1%体积比的体积浓度为3%的L‑谷氨酰胺+1%体积比的抗生素，在温度为33+0.5℃，CO2体积浓度为5%的环境中恒温培养；培养至第五天时，于相同环境条件下，按3.5%的体积比补加体积浓度为7%w/v的NaHCO3, 培养9‑10天，显微镜下观察细胞出现CPE达++++时，将细胞培养瓶放置‑20℃反复冻融3次，收集细胞培养液，于4℃3500×g离心10分钟，收集上清，获得病毒液；2）、将步骤1）所得病毒液，按1ml病毒液/瓶的量,接种到生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，控制病毒浓度为4.0 MOI，按1:9的体积比补加下列培养液：MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHCO3，1%体积比的体积浓度为3%的L‑谷氨酰胺，1%体积比的抗生素，在温度为33+0.5℃， CO2体积浓度为5%的环境中恒温培养；培养至第五天时，于相同环境条件下，按2%的体积比补加体积浓度为7%的NaHCO3, 培养9‑10天，显微镜下观察细胞出现CPE达++++时，将细胞培养瓶放置‑20℃反复冻融3次，收集细胞培养液，于4℃3500×g离心10分钟，收集上清，获得病毒液；如此反复连续传代培养三代以上，直至获得传代稳定的I型登革病毒液；3）、按1ml病毒液/瓶的量，将步骤2）所得传代稳定的I型登革病毒液，接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，并控制病毒浓度为4.0 MOI，按1:9的体积比补加下列培养液：MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHCO3+1%体积比的体积浓度为3%的L‑谷氨酰胺+1%体积比的抗生素，在温度为35+0.5℃，CO2体积浓度为5%的环境中恒温培养；培养至第三天时，在相同环境条件下，按2%的体积比补加体积浓度为7%的NaHCO3, 培养7天，显微镜下观察细胞出现CPE时，将细胞培养瓶放置‑20℃冻融3次，收集细胞液，4℃ 3500×g离心10分钟，无菌条件下收集上清，获得病毒液并于‑70℃下保存；4）、将步骤3）获得的病毒液反复冻融2次，于4℃，3500×g离心分离10min，收获上清，得病毒液；将该病毒液按1ml病毒液/瓶的量，接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，按1:9的体积比补加下列培养液：MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHCO3+1%体积比的体积浓度为3%的L‑谷氨酰胺+1%体积比的抗生素，在温度为35+0.5℃，CO2体积浓度为5%的环境中恒温培养；培养至第三天时，于相同环境条件下，按2%的体积比补加体积浓度为7%的NaHCO3, 培养7天，显微镜下观察细胞出现CPE时，将细胞培养瓶放置‑20℃冻融3次，收集细胞液，4℃ 3500×g离心10分钟，无菌条件下收集上清，获得病毒液，如此反复连续传代培养10代以上，至KMB17细胞CPE达++++时，即筛选出能在KMB17上稳定传代增值的I型登革病毒细胞适应株；5）用KMB17细胞对步骤4）筛选出的能在KMB17上稳定传代增值的I型登革病毒细胞适应株进行下列噬斑筛选纯化：弃去6 孔板中已生长成单层的KMB17细胞的培养液，用Hanks 液漂洗2 次；在不含血清的下列维持液中：MEM培养基+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHCO3+1%体积比的体积浓度为3%的L‑谷氨酰胺+1%体积比的抗生素，将步骤4）的I型登革病毒细胞适应株稀释至4.0MOI浓度后，接种KMB17细胞，置37+0.5 ℃孵育4h，每隔15min 轻轻水平晃动培养板数次，以保证病毒与细胞充分接触；吸附完毕后吸出病毒液，加1mL 含有0.1 %体积比的中性红及5%体积比的胎牛血清的MEM琼脂糖培养基,于37+0.5℃，CO2体积浓度为5%的环境中恒温培养；2天后每天观察2次，记录蚀斑出现和生长情况，直至大小适宜时，吸取斑点，以维持液稀释后接种96孔板，收集病变孔的培养液；如此进行3 轮噬斑纯化；通过实验，3轮噬斑纯化均在3天后出现微小斑点，至5‑6天斑点直径长至约8‑10um，筛选出I型登革病毒适应株；此毒株即为能在人胚肺二倍体细胞KMB17上增殖的纯化I型登革病毒适应株；6）将步骤5）收获的纯化I型登革病毒适应株按照步骤4）在人胚肺二倍体细胞KMB17上增殖、分装，于‑70℃下长期保存，备用。...
【技术特征摘要】
1.一种I型登革病毒KMB17细胞适应株，其特征在于通过下列步骤获得: 1)、按Iml病毒液/瓶的量，将浓度为4.0 MOI的I型登革病毒液接种到生长致密、透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，按1:9的体积比补加下列培养液:MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHC03+l%体积比的体积浓度为3%的L-谷氨酰胺+1%体积比的抗生素，在温度为33土0.5°C，C02体积浓度为5%的环境中恒温培养；培养至第五天时，于相同环境条件下，按3.5%的体积比补加体积浓度为7%w/v的NaHC03，培养9-10天，显微镜下观察细胞出现CPE达++++时，将细胞培养瓶放置_20°C反复冻融3次，收集细胞培养液，于4°C 3500 Xg离心10分钟，收集上清，获得病毒液； 2)、将步骤I)所得病毒液，按Iml病毒液/瓶的量，接种到生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，控制病毒浓度为4.0 Μ0Ι，按1:9的体积比补加下列培养液:MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHC03，1%体积比的体积浓度为3%的L-谷氨酰胺，1%体积比的抗生素，在温度为33土0.5V，CO2体积浓度为5%的环境中恒温培养；培养至第五天时，于相同环境条件下，按2%的体积比补加体积浓度为7%的NaHC03，培养9-10天，显微镜下观察细胞出现CPE达++++时，将细胞培养瓶放置_20°C反复冻融3次，收集细胞培养液，于4°C 3500 Xg离心10分钟，收集上清，获得病毒液；如此反复连续传代培养三代以上，直至获得传代稳定的I型登革病毒液； 3)、按Iml病毒液/瓶的量，将步骤2)所得传代稳定的I型登革病毒液，接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，并控制病毒浓度为4.0 Μ0Ι，按I: 9的体积比补加下列培养液:MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHC03+l%体积比的体积浓度为3%的L-谷氨酰胺+1%体积比的抗生素，在温度为35土0.5°C，CO2体积浓度为5%的环境中恒温培养；培养至第三天时，在相同环境条件下，按2%的体积比补加体积浓度为7%的NaHC03，培养7天，显微镜下观察细胞出现CPE时，将细胞培养瓶放置_20°C冻融3次， 收集细胞液，4°C 3500Xg离心10分钟，无菌条件下收集上清，获得病毒液并于-70°C下保存； 4)、将步骤3)获得的病毒液反复冻融2次，于4°C，3500Xg离心分离lOmin，收获上清，得病毒液；将该病毒液按Iml病毒液/瓶的量，接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，按1:9的体积比补加下列培养液:MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3.5%体积比的体...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙强明，赵玉娇，陈俊英，潘玥，黄新伟，李多，丁晓洁，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53
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