本发明专利技术公开了一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白，它包括鞭毛蛋白，以及人巨细胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段；本发明专利技术公开了编码前述融合蛋白的DNA分子，以及包含该DNA分子的重组质粒和重组表达载体；本发明专利技术公开了该融合蛋白的制备方法和用途；本发明专利技术还公开了一种人巨细胞病毒疫苗。本发明专利技术融合蛋白的免疫原性强，可刺激机体产生大量抗巨细胞病毒抗体，用于制备疫苗以预防巨细胞病毒感染引起的疾病，具有良好的临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法。
技术介绍
人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)属于β -疱疫病毒亚科双链DNA病毒，是最常见的机会性感染病毒，其感染具有种属特异性。HCMV感染率因地方不同、年龄不同表现出明显差别。发达国家HCMV抗体阳性率在50 % 80 %;而发展中国家，80 %的小儿在3岁前感染HCMV，至成人期，HCMV感染率甚至可达100 %。我国人群感染率高达86%_96%。健康人多呈亚临床型感染或者潜伏感染，无明显临床症状，部分患者可有与传染性单核细胞增多症相似的表现。但是HCMV感染确是引起器官移植受者术后并发症、HIV感染者死亡以及新生儿先天缺陷的重要病因。 目前对HCMV感染和HCMV相关疾病的预防和治疗方法是使用抗病毒药物(如更昔洛韦(ganciclovir),纟颜更昔洛韦(Valganciclovir),膦甲酸(Foscarnet)等)以及人巨细胞病毒特异性免疫球蛋白(HCMV-IVIG)。长时间的药物治疗会对患者产生药物毒性和以及造成病毒产生耐药性，HCMV-IVIG尽管有一定效果，但是治疗费用相对昂贵，接种疫苗是一种比较好的的预防/治疗方式。现有的人巨细胞病毒疫苗有减毒活疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗、基因工程亚单位疫苗和合成肽疫苗等种类。减毒活疫苗因存在回复突变的可能性以及潜在的致癌性，且保护效力也不强；病毒载体疫苗和DNA疫苗也存在安全性和保护力相对较弱的问题；现有报道的基因工程亚单位疫苗和合成肽疫苗的有效性较差，如，Pass，R.F.et al. “A subunitcytomegalovirus vaccine based on recombinant envelope glycoprotein B and a newadjuvant.，，，J. Infect. Dis. 1999，180，970975 报道了一种添加佐剂 MF59 (一种角鲨烯类乳剂)的重组包膜蛋白B亚单位疫苗，其I期临床研究显示，新佐剂MF59与30 μ g重组gB配伍免疫效果和安全性均优于传统铝佐剂与10(^8重组88。三次免疫后，受试者体内的gB抗体和中和抗体水平高于血清阳性对照,但免疫后体内产生的抗体水平明显下降,尽管第四次免疫可以加强机体应答并产生高水平抗体，但是12个月后抗体中水平又下降到基线水平。并且，文中作者明确阐明“该疫苗有可能降低CMV的胎儿感染率，但不能防止育龄妇女感染”。基于MF59的作用以及Pass的分析，MF59/gB随后进行了 II期临床试验。如“Vaccine Prevention of Maternal Cytomegalovirus Infection”，N Engl J Med. 2009,360:1191-1199报道，II期临床试验以检测到CMV感染为主要判定终点，三次接种后，其预防CMV感染效果仅为50%，这一结果进一步说明该疫苗的局限性。为了满足更广泛的临床需求，需要开发新的免疫原或者疫苗。鞭毛是沙门菌运动性的基础结构，鞭毛蛋白是鞭毛丝状部组成元件。研究发现，鞭毛蛋白作为天然免疫应答的诱导剂，诱导产生的天然免疫应答可帮助建立针对外源抗原的获得性免疫应答，从而显示出鞭毛蛋白作为免疫佐剂的特性。
技术实现思路
为了解决现有人巨细胞病毒疫苗有效性差的问题，本专利技术提供了一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白。本专利技术人巨细胞病毒免疫原融合蛋白包括鞭毛蛋白，以及人巨细胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段。所述人巨细胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段代替鞭毛蛋白的高变区。所述鞭毛蛋白为肠炎沙门菌亚属(Salmonella enterica)鞭毛蛋白2型。所述鞭毛蛋白的核苷酸编码序列如SEQ ID NO: I所示。所述人巨细胞病毒包膜糖蛋白为包膜糖蛋白B或者包膜糖蛋白H。所述人巨细胞病毒包膜糖蛋白多肽片段的核苷酸编码序列如SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 8 或者 SEQ ID NO 10 所示。优选地，人巨细胞病毒免疫原融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 12, SEQ IDNO :14、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 18 或者 SEQ ID NO 20 所示。其核苷酸编码序列如 SEQID NO 1USEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15, SEQ ID N0:17 或者 SEQ ID N0:19 所示。本专利技术还提供了SEQ ID NO 1USEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15, SEQ ID N0:17 或者SEQ ID NO 19所示核苷酸序列。本专利技术还提供了一种重组质粒，其包括SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 13,SEQ ID NO:15、SEQ ID N0:17或者SEQ ID NO :19所示核苷酸序列，如，重组pET42b质粒。本专利技术还提供了一种重组表达载体，其包括前述重组质粒，如，重组大肠杆菌Rossetta0本专利技术还提供了前述融合蛋白的制备方法，它包括如下步骤(I)取前述的重组表达载体，用IPTG诱导表达；(2)离心，得沉淀，分离纯化，即得融合蛋白。本专利技术还提供了前述融合蛋白在制备人巨细胞病毒疫苗中的用途。本专利技术最后提供了一种人巨细胞病毒疫苗，它包含前述任意一项融合蛋白。本专利技术制备得到了鞭毛蛋白与人巨细胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段的融合蛋白，该融合蛋白的免疫原性强，用于制备疫苗的免疫效果好，临床应用前景良好。人巨细胞病毒由内向外分为衣壳、被膜和包膜三个主要结构，含有的抗原众多，如，即刻早期蛋白 I (immidiate early proteinl, IE1)、憐蛋白 65 (phosphoprotein65,pp65)憐蛋白 150 (phosphoproteinl50,ppl50)、憐蛋白 28 (phosphoprotein28,pp28)、包膜蛋白PUL128、包膜蛋白pUL130、包膜蛋白pUL131A、包膜糖蛋白B、(glycoprotein B,gB)、包膜糖蛋白H (glycoprotein H,gH)、包膜糖蛋白M (glycoprotein M，gM)等。研究发现，不是所有人巨细胞病毒抗原与鞭毛蛋白形成的融合蛋白均可得到免疫原性较强的免疫原，本专利技术在大量抗原中选择人巨细胞包膜糖蛋白与鞭毛蛋白结合，制备得到了免疫原性较强的免疫原。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图I pET42b/FljB酶切鉴定结果，泳道I为pET42b/FljB NdeI/BamHI酶切产物，泳道2为IOObp DNA ladder ;箭头所指FljB片段图2 pET42b/FljB-ADl酶切鉴定结果图，泳道I为IOObp DNA ladder ;泳道2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白，其特征在于：它包括鞭毛蛋白，以及人巨细胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘兰军，武志强，李小娇，葛永红，
申请(专利权)人：成都蓉生药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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