巨细胞病毒(CMV)的基因变体制造技术

本发明专利技术涉及CMV基因变体，所述基因变体缺失CMV的IE区域的内含子2(CMV?IEΔi2)。本发明专利技术也涉及这种基因变体以及从其转录的RNA剪接变体和从所述RNA剪接变体表达的蛋白的多种应用，例如用于诊断CMV相关癌症疾病，和鉴定个体患癌的风险或随着人样品转移CMV?IEΔi2病毒的风险，并且就免疫治疗和疫苗接种而言通过靶向独特CMV?IE蛋白进行预防和治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】巨细胞病毒(CMV)的基因变体
本专利技术涉及新的巨细胞病毒(CMV)基因变体，例如显示在癌症疾病患者中出现的基因变体。因此，本专利技术涉及癌症诊断方法的领域，更特定涉及出现巨细胞病毒(CMV)感染的癌症形式。本专利技术特别关注诊断成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肉瘤、肾癌、皮肤癌和胰腺癌，并且也适用于其他癌症形式。专利技术背景巨细胞病毒(CMV)是感染世界上大部分人口的常见病毒；60-100%的成年群体经历过这种感染，并且是所述病毒的载体。在初次感染后，CMV形成潜伏状态并有持久性，并且大部分感染是亚临床的。在健康载体中，优先发现所述病毒是骨髓谱系细胞中的潜伏病毒，并且病毒的重新活化依赖于细胞分化为成熟巨噬细胞或树突细胞，所述分化通常由炎症造成。直到20世纪70年代，仅认为严重的先天性感染病例代表所述病毒引起的人类疾病。随着社会中免疫抑制个体(例如AIDS患者和移植患者)的增加，CMV的重新活化成为在这些患者中造成高发病率和死亡率的主要临床问题。因此,在过去的几十年中，CMV的重要`性和感兴趣程度增加，因为CMV疾病在这组患者中常见，并且可能危及生命。所述病毒通过炎症重新活化，并且越来越多的证据表明了所述病毒频繁地出现在炎症疾病患者的组织样品中。近来，越来越多的证据也提示了不同来源的癌症中存在活性CMV感染。我们定义了癌症中新的CMV基因变体，并且显示了新的患癌机理。CMV感染和癌症近期报导揭示了在某些恶性肿瘤中频繁出现CMV的基因组和蛋白，所述恶性肿瘤例如结肠癌、恶性胶质瘤(1-7)、髓母细胞瘤(8)、EBV阴性霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、前列腺癌和乳腺癌(综述参见(9，10))。我们证明了在99%恶性成胶质细胞瘤、>90%髓母细胞瘤(MB)和神经母细胞瘤(NB)、恶性黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、卵巢癌和宫颈癌中存在活性CMV感染(1，8)。重要地是，所述病毒感染在从相同患者获得的非癌症组织样品中和健康对照个体中保持潜伏(1，3)。CMV 和癌症调节(oncomodulation):在20世纪70年代，Fred Rapp小组已经报导了在前列腺癌中频繁出现CMV，并且从动物模型致癌肿瘤中分离出病毒株(11，12)。在数个稍后的研究中，CMV不能转化正常人体细胞，所以并不认为这种病毒是致癌的。相反，提出了术语癌症调节来描述CMV对由数种特定影响宿主细胞功能的病毒蛋白所介导肿瘤发生的间接影响(综述参见(13，14))。进化中，CMV发展出了影响很多不同细胞和免疫功能的复杂机理(15，16)。所述病毒在感染细胞中生成约170种蛋白，其中大约仅有50种对病毒生成是必需的(17)。因此，绝大部分病毒蛋白用于控制帮助病毒与其宿主共同生存的重要宿主功能。这些蛋白可以通过控制宿主功能对癌症发展起作用，并且通过调节免疫反应，受病毒感染的肿瘤细胞会受到保护避免被免疫系统发现(15)。可能涉及癌症发病的CMV机理称为癌症调节(oncomodulatory)机理(10， 13)。癌症调节定义为在肿瘤细胞提供的合适遗传环境中提高癌症发生过程的能力，所述癌症发生过程表征为破坏细胞内信号通路、转录因子和肿瘤抑制蛋白。CMV能阻滞细胞分化、干扰癌基因表达、诱导特异染色体断裂、抑制DNA修复机制、控制重要的表观遗传功能、控制细胞增殖、抑制细胞凋亡、诱导血管新生和细胞迁移，这些都提供了癌症调节机理(10，13)。较新的数据也提示了这种病毒可以是致癌的；一项研究显示了事实上，CMV蛋白US28的表达通过诱导的C0X-2表达和VEGF生成造成自身造成鼠模型中的肿瘤发育(18，19)。祀向转基因小鼠肠上皮的US28的表达造成了肠增生、腺瘤(adenoma)和腺癌(adenocarcinoma) (20)。与Smits小组合作,我们近期显示了 US28也引起STAT3磷酸化，生成IL-6并产生增殖表型。例如,成胶质细胞瘤中STAT3的磷酸化与成胶质细胞瘤患者的存活相关(6)。我们近期也发现了 CMV蛋白IE72通过与启动子中SP-1结合位点的相互作用来诱导高端粒酶活性(7)。诱导端粒酶活性是致癌病毒的常见现象。有趣地是，我们发现了 GBM肿瘤中仅仅CMV感染的细胞显示了增加的hTERT表达(7)。我们近期发现了 CMV感染水平与成胶质细胞瘤患者存活延长相关联，进一步证明CMV感染在癌症中的重要作用`(I)。再者，成胶质细胞瘤中CMV感染的水平是患者存活的较强预后因子。诊断中肿瘤低级CMV感染(定义为少于25%病毒阳性细胞)的患者存活时间比高级感染患者长2.5倍(21)。体外，更昔洛韦治疗抑制肿瘤生长达80-95%，并且动物模型显示了使用靶向病毒复制的药物使肿瘤生长抑制40-75% (8，22)。CMV逃避免疫系统的检测CMV发展出设计成避免被免疫系统识别的复杂机理。例如，CMV抑制I类和II类HLA分子的表达和抗原呈递，其控制T细胞活化、抑制NK细胞活化、保护细胞免受从活化T和NK细胞释放的细胞溶解肽影响(16，23)。CMV也自身生成，并且控制细胞生成趋化因子、细胞因子和生长因子(15)。这些是使免疫系统不能识别感染细胞的策略示例，并且可以解释为什么CMV感染肿瘤不受免疫系统或针对其开发的免疫治疗的控制。因此免疫系统不能识别感染的肿瘤细胞(综述参见(16，23)，同时所述病毒依赖于炎症(24)。我们小组第一次鉴定了骨髓谱系细胞是潜伏病毒的主要循环载体(24)，并且T细胞的免疫活化和后续生成TNF- a和IFN- y (造成巨噬细胞分化)是潜伏CMV重新活化的关键因素(24，25)。病毒感染也诱导C0X-2(18，26-28)，并且我们近期发现了所述病毒也诱导5-L0表达(29)以诱导炎症和增强病毒复制，所述表达在肿瘤生物学中有高相关性。CMV基因产物赋予化疗抗性细胞凋亡，或程序性细胞死亡是NK细胞和细胞凋亡T细胞介导的杀伤机制的最后步骤。肿瘤细胞对药物诱导死亡的灵敏度减弱是抗癌症治疗失败的主要原因。至少五种不同的CMV蛋白(即IE1、IE2、UL36和UL37、UL38)抑制细胞凋亡，并且可以增强CMV感染肿瘤细胞的存活。这些蛋白也可以防止所需的化疗作用。神经母细胞瘤细胞中UL36的表达赋予化疗抗性(30)，支持了这种假说。癌症中CMV致密体的关键作用越来越多的数据显示了不同来源的癌症中频繁检测出CMV蛋白。>90的成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌、胰腺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、卵巢癌、宫颈癌显示了肿瘤细胞中的高CMV蛋白表达，但是肿瘤周围的非肿瘤组织中都是病毒阴性。我们也检测了患者活检，并且发现它们就CMV蛋白表达而言都为高阳性。CMV蛋白在肿瘤中广泛表达，并且CMV RNA转录物容易检测，但与此形成鲜明对比的是，相同组织样品中难于检测CMV DNA。这是一个迷惑了本领域诸多研究员的有争议的议题，并且这是否是人为假象(artefact)也引起了关注。因此，本领域长期需要揭示CMV感染策略和其如何影响如癌症的开始或进展，并对其进行广泛研究。这归因于以下事实:这种揭示可以发现能更早治疗所需患者的潜在诊断方法以及可能本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种巨细胞病毒(CMV)基因变体，其特征在于，缺失CMV基因组立即早期(IE)基因的内含子2(SEQ?ID:17)(CMV?IEΔi2)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.15 US 61/475,9261.一种巨细胞病毒(CMV)基因变体，其特征在于，缺失CMV基因组立即早期(IE)基因的内含子 2 (SEQ ID: 17) (CMV IEAi2)。2.如权利要求1所述的基因变体，其特征在于，缺失的是Merlin参照序列AY446894.2 (野生型CMV)的位点173903到位点174019的核酸序列。3.—种从权利要求1-2中任一项所述的基因变体转录获得的RNA剪接变体。4.如权利要求3所述的RNA剪接变体，其特征在于，所述剪接变体由CMVIE基因的外显子2和3，和/或其一个或多个部分组成。5.如权利要求3所述的RNA剪接变体，其特征在于，所述剪接变体由CMVIE基因的外显子2、3和4，和/或其一个或多个部分组成。6.如权利要求3所述的RNA剪接变体，其特征在于，所述剪接变体由CMVIE基因的外显子2、3和5，和/或其一个或多个部分组成。7.一种由权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体或由权利要求3-6中任一项所述的RNA剪接变体所编码的蛋白，所述蛋白选自大小约150、125、76、75、72、55、53、50、40、38、36、32、31、30、25、19、18、14、12 和 IOkDa 的 CMV 蛋白。8.在生物样品中检测是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMVIE A i2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的RNA剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多 种蛋白的方法，所述方法包括如下步骤: a)提供来自所述哺乳动物的生物样品； b)通过对步骤b)所得样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求4-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白。9.在生物样品中检测是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMVIE A i2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的RNA剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白的方法，所述方法包括如下步骤: a)对所述样品进行技术分析，然后 b)在所述生物样品中检测是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白。10.检测哺乳动物患癌倾向的方法，所述方法包括如下步骤: a.提供来自所述哺乳动物的生物样品， b.通过对步骤a)所得样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白，和 c.在所述生物样品中检测是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMVIE A i2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从其翻译的一种或多种蛋白，以测定所述哺乳动物患癌的倾向。11.检测哺乳动物患癌倾向的方法，所述方法包括如下步骤: a)通过对生物样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白，和 b)基于所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMVIE A i2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从其翻译的一种或多种蛋白确定所述哺乳动物患癌的倾向。12.诊断哺乳动物巨细胞病毒(CMV)相关癌症形式的方法，所述哺乳动物载有CMV感染，所述方法包括如下步骤: a)提供来自所述哺乳动物的生物样品； b)通过对步骤a)所得样品进行技术分析测定所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从其翻译的一种或多种蛋白，和 c)基于在所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的剪接变体和/或从其翻译的蛋白诊断所述哺乳动物是否有CMV相关癌症疾病。13.诊断哺乳动物巨细胞病毒(CMV)相关癌症形式的方法，所述哺乳动物载有CMV感染，所述方法包...

【专利技术属性】
技术研发人员：赛西莉亚·那乌克勒，
申请(专利权)人：赛西莉亚·那乌克勒，
类型：
国别省市：