橙黄网胞盘菌凝集素反应性免疫球蛋白检测技术的建立及应用制造技术

本发明专利技术属于蛋白质技术领域，涉及糖蛋白的检测，具体涉及与橙黄网胞盘菌凝集素反应的免疫球蛋白水平的检测方法及其应用，包括计算与橙黄网胞盘菌凝集素反应的免疫球蛋白量/血清免疫球蛋白总量。该方法尽管不能区分健康和乙肝感染患者，但是可用于鉴别诊断乙肝感染患者中的肝癌和非肝癌患者。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白质
，涉及糖蛋白的检测，具体涉及橙黄网胞盘菌凝集素反应性免疫球蛋白水平检测方法及其在原发性肝癌中的创新性诊断价值。该方法尽管不能区分健康和乙型肝炎病毒(HBV)感染患者，但是可作为不能得出直接诊断结果的中间步骤用于同检测HBV的步骤公用以区分经诊断是HBV感染者中的肝癌和肝硬化患者。
技术介绍
近年来人们逐渐清楚地认识到蛋白糖基化修饰在很多疾病的发生发展中扮演着重要角色。肝脏是重要的蛋白质合成、加工场所，与血清蛋白的糖基化状态密切相关。我国是HBV感染大国，我们在前期研究中已分别发现了 HBV感染后、肝硬化及肝癌患者血液中的特征性N-糖结构标志物。但有关这种糖标志物的靶蛋白分子及其意义尚存在争议。下面以免疫球蛋白G为例介绍本专利技术的技术背景。IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白类型(占人血清Ig的80%)，其结晶段(Fe) 含有唯一的N-糖基化修饰保守位点，即Asn-297。Asn-297糖链由于核心七糖上连接的末端糖基不同，存在着种属、组织、年龄和性别特异性。研究提示IgG的Fc段糖基化修饰状态与多种疾病密切相关，例如随类风湿性关节炎的发生、发展，IgG低半乳糖基化修饰的程度增加；晚期卵巢癌病人拥有高水平不对称寡糖结构的Con A结合(高甘露糖)的IgG，该异常糖链存在于IgG的恒定区。IgG糖基化与功能密切相关。连接在Asn197的糖链可维持抗体的四级结构以及Fc段的热稳定性，并通过影响IgG分子与FcRs、Clq以及Fcfoi的结合而分别调节IgG分子的抗体依赖细胞毒作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)以及半衰期。HBV感染是亚洲太平洋地区的高发性疾病，全世界每年都会新增HBV感染病例五千万例，其中10-40%将发展为慢性肝病，并最终发展为肝纤维化、肝硬化和原发性肝细胞癌(HCC)。由于缺乏有效的诊断标志物，经常要在原发性肝细胞癌发展到晚期才能发现， 这使得原发性肝细胞癌的五年生存率极低(只有6%左右)。早期诊断和治疗是将显著提高原发性肝细胞癌患者的生存质量。目前临床上的常用血清标志物甲胎蛋白在1/3的人群中仍处于正常水平。这使得原发性肝细胞癌的早期诊断和治疗更加困难。现有文献没有报道橙黄网胞盘菌凝集素反应性免疫球蛋白与HBV相关肝病(包括慢性乙肝、肝硬化和肝癌)的直接相关性。本专利技术人经过长期研究开发了橙黄网胞盘菌凝集素反应性免疫球蛋白的检测方法，发现尽管该方法本身无法区分健康人群和乙型肝炎病毒(HBV)感染患者或HBV感染者中的肝癌和肝硬化患者，但是它在与HBV的检测方法联用的情况下，可以用于区分HBV感染者中的肝癌和肝硬化患者，从而可以作为诊断肝癌和肝硬化的中间步骤
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种橙黄网胞盘菌凝集素反应性免疫球蛋白水平的检测方法，并将该方法用于慢性乙肝(CHB)、肝硬化(LC)、原发性肝细胞癌(HCC)橙黄网胞盘菌凝集素反应性免疫球蛋白水平的中间步骤检测，可作为无创性原发性肝细胞癌(HCC)监测、 诊断中所需的中间结果，也为可能的免疫调控干预提供了潜在的治疗靶点。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了一种检测血清橙黄网胞盘菌凝集素反应免疫球蛋白水平的非诊断方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(A)血清样品通过凝集素亲和层析，收集橙黄网胞盘菌凝集素反应糖蛋白；(B)检测收集的橙黄网胞盘菌凝集素反应蛋白中的免疫球蛋白量(简称为 A-Ig)；(C)计算橙黄网胞盘菌凝集素反应的免疫球蛋白量/血清免疫球蛋白总量。其中，血清样品是离体样品，优选是人血清样品。本专利技术的方法不包括从生物体取样的步骤。优选其中，所述的凝集素是橙黄网胞盘菌凝集素(简称为A)。通常，Ig被表示为免疫球蛋白或其数量(在数学公式中)，因此在本文中，橙黄网胞盘菌凝集素反应的免疫球蛋白或其数量被简称为A-Ig。优选其中，该方法不包括检测血清样品的HBV感染性。由于本专利技术的方法不能区分健康人群和慢性乙肝患者，而对于其他疾病患者(如，HIV感染者)也不具有诊断依据， 只能用于判断HBV感染的患者中原发性肝细胞癌的倾向。因此，当不清楚血清样品是否是来自HBV感染的患者中的时候，即使是有经验的医师，也无法根据与橙黄网胞盘菌凝集素反应的免疫球蛋白量/血清免疫球蛋白总量这一比值直接诊断出是否患有原发性肝细胞癌或其倾向(包括其他误诊情况)。因此，本专利技术的方法是可以用于原发性肝细胞癌诊断过程中得出非充分中间结果的过程。优选其中，橙黄网胞盘菌凝集素反应的免疫球蛋白量通过免疫比浊法来检测。在本专利技术的具体实施方式中，就是通过优选的方式进行检测。优选其中，该方法进一步包括橙黄网胞盘菌凝集素反应的免疫球蛋白量/血清中免疫球蛋白总量的比值与50%相比较的步骤。这样，如果进一步检测出血清样品是来自 HBV感染患者的血清(尽管这一检测不包括在本专利技术的方法中)，这可以直接判断该患者是否有原发性肝细胞癌的倾向。另外其中，该方法也可以不包括与橙黄网胞盘菌凝集素反应的免疫球蛋白量/血清中免疫球蛋白总量的比值与24. 50%相比较的步骤。在第二方面，本专利技术提供了用于本专利技术第一方面的方法的检测系统，其特征在于该系统包括预装凝集素亲和层析柱、生化分析仪、输入设备、计算设备和输出设备，其中输入设备能将与橙黄网胞盘菌凝集素反应的免疫球蛋白量和血清免疫球蛋白总量输入计算设备，计算设备能计算A-Ig/Ig值。这些仪器本身是常规设备，但是它们组合在一起的系统是本专利技术人对本专利技术第一方面的方法进行研究后的结果。计算设备可以是个人电脑、服务器，也可以是只能做除法的计算设备，后者已经能够满足本专利技术的系统对计算设备的要求。优选其中，凝集素亲和层析柱是橙黄网胞盘菌凝集素亲和层析柱。在另一个方面，本专利技术提供了本专利技术第二方面的检测系统在制造用于本专利技术第一方面的方法的装置中的应用。在第三方面，本专利技术提供了本专利技术第一方面的检测血清橙黄网胞盘菌凝集素反应免疫球蛋白水平的方法在诊断原发性肝细胞癌中的应用，其中还进一步包括检测血清样品是否是HBV感染者的血清样品的步骤。优选其中，包括诊断个体是HBV感染者并采集血清样品供本专利技术第一方面的检测血清橙黄网胞盘菌凝集素反应免疫球蛋白水平的方法中使用。附图说明图1 四组患者 Ig、A_Ig 及 A-Ig/Ig 测定结果(χ士 s，g/L)。**表示与其它两组均有统计学差异(P < 0. 05)图2 从肝硬化(LC)中辨别诊断原发性肝细胞癌(HCC)时，A-Ig/Ig和AFP的ROC 曲线。具体实施例方式下面结合附图及实施例对本专利技术进行详细描述。实施例1 正常对照组(Control)、慢性乙肝组(CHB) ,HBV肝硬化(LC)组和HBV肝癌(HCC)组与橙黄网胞盘菌凝集素反应免疫球蛋白的检测分析。收集2006年9月 2009年9月来上海市东方肝胆外科医院接受治疗并明确诊断的慢性乙型肝炎(CHB)、LC(肝硬化)患者的血清各30例，原发性肝细胞癌(HCC)患者血清 49例，其中每组男/女为13 2;平均年龄51. 6士13. 2岁。所有入选患者还必须满足以下标准(1)均为乙型肝炎病毒(HBV)感染的乙肝患者；(2)由于经研究发现，其他病毒的感染者与正常对照组的(橙黄网胞盘菌凝集素反应性)的TP，ALB和免疫球蛋白均本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种检测与橙黄网胞盘菌凝集素反应的免疫球蛋白水平的非诊断方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（Ａ）血清样品通过凝集素亲和层析，收集与橙黄网胞盘菌凝集素反应的糖蛋白；（Ｂ）检测收集的与橙黄网胞盘菌凝集素反应的免疫球蛋白量；（Ｃ）计算与橙黄网胞盘菌凝集素反应免疫球蛋白量（Ａ－ＩｇＧ）／血清免疫球蛋白总量（ＩｇＧ）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高春芳，衣常红，房萌，赵云鹏，顾星，季君，王慧，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院，
类型：发明
国别省市：31