一种产生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种产生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法，此蛋白质在有功能时具有至少一个二硫键，此方法包括如下步骤：提供一种包含编码蛋白质的基因且此基因可在其中表达的细菌细胞；在使此基因表达的条件下培养此细胞；从该细胞中分离出此蛋白质而不还原它；以及使分离出的蛋白质经受折叠处理。优选地，此免疫球蛋白超家族蛋白是选自如下种类的蛋白质：抗体、免疫球蛋白可变（Ｖ）区、免疫球蛋白恒定（Ｃ）区、免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、Ⅰ类和Ⅱ类组织相容性分子、β↓［２］微球蛋白（β↓［２］ｍ）、淋巴细胞功能相关抗原－３（ＬＦＡ－３）和ＦｃｒＲⅢ，ＣＤ７、ＣＤ８、Ｔｈｙ－１和Ｔｐ４４（ＣＤ２８）、Ｔ细胞受体、ＣＤ４、多免疫球蛋白受体－神经细胞粘附分子（ＮＣＡＭ）、髓鞘相关糖蛋白（ＭＡＧ）、髓鞘Ｐ蛋白、癌胚抗原（ＣＥＡ）、血小板衍生生长因子受体（ＰＤＥＦＲ）、集落刺激因－１受体、αβ－糖蛋白、ＩＣＡＭ（细胞间粘附分子）、血小板以及白介素。本发明专利技术的重要实施方案是一种可通过本发明专利技术方法获得的稳定的无肽ＭＨＣ蛋白以及一种试剂盒，此试剂盒包含使其接受者能够产生和测定或检测出功能性ＭＨＩ Ⅰ类蛋白的ＭＨＣ Ⅰ类链和β↓［２］ｍ，对此蛋白质可以加入能够结合于该ＭＨＣ Ⅰ类蛋白而导致形成功能性ＭＨＣ Ⅰ类蛋白的肽。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
专利技术简述人类免疫系统的特异性和反应性受MHC(在人HLA中)分子控制。HLA的功能是对免疫T细胞选择和呈递抗原肽。可以认为免疫系统是通过MHC视孔观察世界，任何一种合理的免疫操作途径都必须考虑到MHC。这类合理的途径应该具有多种科研、实用或临床的价值。为了开发这些可能性，我们设计了一种方法，以新颖并且简便、可靠和价廉的方式产生高纯度的重组MHC分子。这些重组分子作为肽结合剂和T细胞激活剂具有充分的功能活性。可以使它们构成二种不同的形式a)作为完全成熟的肽填充部分，它非常稳定并具有极强的T细胞激活性，b)作为部分成熟的无肽部分(“空”MHC分子)，它具有合理的稳定性和肽易接受性。应该注意到，后一种结果修正了当前关于“空”MHC分子就是不存在的，或者至少是极不稳定的错误概念。我们已知的产生重组或非重组MHC的所有其它方法，都更加麻烦并且/或者只能得到具有局限功效和纯度的产品。MHC分子的复杂性和不良稳定性导致要产生肽易接受性纯MHC分子将非常因难，因而要产生预定的纯肽-MHC复合物也非常困难。作为出自天然来源的天然分子，MHC分子的产物是缓慢和低产率的。并且只能用很麻烦的方法纯化它们，导致制备物中MHC被大量不同的肽预先占据了，并且有时还污染了其它MHC单倍型，最终结果是非常受污染的制备物。产生MHC分子的难题综合起来是MHC基因座的极端多态性。在人类群体中存在400个以上不同的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因，并存在200个以上HLA-D等位基因。这种多样性当然具有免疫学目的，但是对于产生MHC是一种实际障碍，因为需要产生许多不同的MHC，并且需要对它们单独地最优化、确认、鉴定和储存等。重组表达系统可能具有多种优点。可能获得较高的产率和设计简便的纯化方案，并且可能用一个特定的肽对其分子作同质性标记。但是这种方法的主要障碍是，正确折叠的MHC结构是由三个成分(重链、轻链(β-2-微球蛋白β2m)和肽)组成的相当复杂的结构。只有三个成分都在一起时MHC方能获得充分的稳定性。特别是不存在其它两个成分时重链极不稳定。因此，很难制备、操作和贮存没有β2m和肽的分离的重链，因而也很难产生MHC分子，它可容易地结合实验者选择的任何一种肽。因为其有限的稳定性，分离的MHC分子会迅速聚集并被丢失，导致最终产率非常差。本专利申请描述了大量产生具有所需任何等位基因特异性的重组MHC分子的一般方法。此方法还首次获得了真正的空MHC分子，并具有相当的稳定性，结果表明这些空分子的结合特征不同于过去产生的MHC所具有的结合特征。合理的预期是，这些空分子与生理性MHC结合有更多的关系，因为它们反映出重新结合状态，而以前使用的MHC分子已反映出更多的人工交换反应。除了改进MHC质量之外，这种新颖的制备方案还简便可靠，容易适合于大部分(可能是全部)MHC分子，并且对于完整功能的纯MHC分子具有高产率。这些重组分子是非常有效的，因为可对它们检测出小至2-4ng分离MHC重链的肽结合活性，并且可检测出小至150ng肽/MHC的T细胞结合能力。它们具非常的亲和活性，类似于对天然存在的分子所测定的亲和性，具有更快的结合速率并可充分地结合(即没有内源性肽)。我们已能够储存这种分子并使它们保持数个月活性。此含义既有分析证明又有治疗证明。最后，所描述的方法已成功地用于其它(非-MHC)分子如CD3复合体成分。实际上，所公开的方法可应用于设计产生任何蛋白质(重组的或非重组的，在原核生物内或真核生物内)，其中在制备的某一阶段蛋白质通过变性或解析叠成为溶剂化物(其目的可能是解除蛋白质的聚集，为了纯化蛋白质等)，以后必须实施恢复/再折叠步骤。因此，本方法可能具有非常大的应用范围。我们推测，特别是它可能用于免疫球蛋白超家族的所有成员，包括抗体、MHC和T细胞受体。它可能用于产生包含至少一个半胱氨酸的所有分子。存在二种MHC亚型，MHC I类和MHC II类。这二种亚型对应于二个T淋巴细胞亚群1)CD8＋细胞毒T细胞，它通常识别由MCH I类分子呈递的肽，杀灭受感染的或突变的细胞，以及2)CD4＋辅助T细胞，它通常识别由MHC II类分子呈递的肽，调节免疫系统其它细胞的应答。MHC I类由非共价结合于12000 MW非糖基化蛋白(β链，也称为β2-微球蛋白)的43000MW跨膜糖蛋白(α链)组成。MHC II类具有类似于MHC I类的整体结构，虽然功能区的分布不同。MHC II类由二个非共价结合的大约34000和29000MW的跨膜糖蛋白组成。对MHC I类和II类分子的详细结构已在X-射线晶体学的水平进行了分析(Bjrkman等，1987)。MHC结构最引人注目的部分是其上部，它显示出一个独特的肽结合凹槽，由形成凹槽围墙的二个α螺旋和形成凹槽底面的第八β-折褶的外套层组成。MHC是非常多形性的，也就是说，人群中存在许多不同的版本(等位基因，同种异型)，但是每个个体只继承了其中的一个或二个(一个来自父亲，另一个来自母亲)。MHC也是多基因的，即在基因组中存在几个MHC编码基因座，使之有可能同时表达几个同种型。重要的是，大多数多形性残基是指向对其大小、形状和功能性起作用的肽结合凹槽(Mrtsumure等1992)。肽-MHC相互作用是特异性的，而虽然较宽，但可使许多无关的肽结合于每种MHC同种异型(Buus等1987)。这种多形性限定了肽结合的特异性，它的生物学结果是，群体中的每个个体培育和形成一套独特的T细胞指令表。MHC特异性的产生从结构上，MHC的肽结合部位形成一个凹槽，还可细分成从A至F的多个口袋。肽-MHC结合能的大多数包含在结合肽的主链原子(包括MHC I类的未端)；其特点对所有的肽都是共同的(Matsumura等1992)。只有少量结合能包含在肽侧链原子，但是认为这些相互作用可解释MHC的特异性。这种机制可解释MHC如何实现宽特异性及高亲和性的肽结合。从功能上，MHC是通过“基元序列”的识别来实现其较宽的肽结合特异性(Sette等1987)。一个基元序列表示出肽结合所需要的重要结构要求，例如在锚定位置中特定氨基酸的存在和适当间隔。相当多的兴趣已集中在理解MHC特异性和基元序列是如何产生的，以及鉴定各种MHC分子的特异性。这种努力的根本目的之一是能够预测肽结合。从MHC的多形性(同为这点在结构和功能上已证明)可以推断，每个MHC同种异型都具有其自己的特异性特征。迄今为止还只能够经过实验描述这些特异性。对MHC特异性的描述和预测目前有二种根本不同的，但互补的方法用于测定MHC的肽结合特异性。一种方法包括对已结合于给定同种异型MHC分子的肽进行测序(Buus等1988；Falk等1991)，而另一种方法包括测定哪些肽将会结合于此MHC(Buus等1986；Olsen等1994)。二种方法各有优缺点。测序的方法使用非人工处理的肽-MHC复合物，但是此方法人为地规定重要的残基、比较不重要的残基和不重要的残基，并且不能够鉴别负相互作用的残基。因此它最适合于鉴别最优势的正相互作用残基。后一种方法是直接结合法，是定量的方法，它可将结合的与不结合的进行比较。此方法可以鉴别和定量正的以及负的相互作用残基。因此如下结果可能不会令人意外与测序的方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法，此蛋白质在有功能时具有至少一个二硫键，此方法包括如下步骤：（ｉ）提供一种包含编码此蛋白质基因的细菌细胞，此基因在该细胞中可表达，（ｉｉ）在使此基因表达的条件下培养此细胞，（ｉｉｉ）从该细 胞中分离出此蛋白质而不还原它，（ｉｖ）使分离出的蛋白质经受折叠处理。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉斯奥斯特加德佩德森，索仁布斯，
申请(专利权)人：拉斯奥斯特加德佩德森，索仁布斯，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]