本发明专利技术涉及一种无防腐剂的注射用马破伤风免疫球蛋白制剂及其制备方法，属于医药技术领域。该制备方法包括提取IgG、消化及加温变性、提取F(ab’)2、明矾吸附除杂质、超滤、柱层析纯化、原液配制及制剂的制备八大步骤。经本发明专利技术工艺制备出的破伤风抗毒素更新换代产品——马破伤风免疫球蛋白F(ab’)2，规格1500IU/0.75ml/瓶，蛋白含量≤50g/L，制剂不含防腐剂。解决了制品去除防腐剂的关键技术要点——大幅降低制品蛋白含量，降低制品本身易受污染程度。经临床试验验证，本发明专利技术的马破伤风免疫球蛋白制剂的不良反应发生率由传统破伤风抗毒素的40～60%下降至10%以下，安全性远远高于传统破伤风抗毒素。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药
，具体涉及一种无防腐剂的注射用马破伤风免疫球蛋白制剂及其制备方法。
技术介绍
破伤风是由破伤风梭菌侵入人体伤口后，在厌氧环境下生长繁殖，产生嗜神经外毒素而引起全身肌肉强直性痉挛为特点的急性传染病。破伤风由于发病率高，发病后不易治疗，死亡率达到20%~50%。世界卫生组织及各国均提倡以预防为主的策略。因此，我国目前对破伤风的普及预防措施之一是儿童在6岁前计划接种破伤风疫苗；此外即为凡因各种原因造成深部创伤的患者，均给予预防破伤风的药物。传统预防破伤风药物为破伤风抗毒素，其工艺技术自上世纪50年代从国外引进后，一直没有改进，制剂蛋白含量高。由于破伤风抗毒素为蛋白类制剂，蛋白含量高，如不添加防腐剂，受微生物污染的风险极高，一旦微生物污染在其中繁殖，产生细菌内毒素，注射进人体后引起发热，严重时危及患者生命。因此，我国破伤风抗毒素产品的制剂处方一直含防腐剂成分。我国药典允许添加至破伤风抗毒素制剂中的防腐剂为硫柳汞和间甲酚。硫柳汞是一种含汞的有机化合物，有毒性。间甲酚是一种有毒有机化合物，对皮肤、粘膜有强烈刺激和腐蚀作用。尽管在制剂中防腐剂浓度低，使用较安全，但制剂中防腐剂的毒性问题一直存在争议。防腐剂应用于生物制品（疫苗、抗血清制品）处方中已有60多年历史。目前我国部分疫苗产品已禁止添加防腐剂。由于破伤风抗毒素蛋白含量高，去除防腐剂存在较高污染风险，因此，国内的破伤风抗毒素均含防腐剂。去除防腐剂需要的关键技术要点包括：生产环境无菌操作、制剂包装密封性、制品本身易受污染程度等。其中生产环境无菌操作、制剂包装密封性可通过厂房设施设备来达到要求，但制品本身易受污染程度，如破伤风抗毒素的蛋白含量，其含量越低，越不易受微生物污染。需通过工艺技术创新达到降低破伤风抗毒素蛋白含量要求。传统破伤风抗毒素生产工艺包括消化及加温变性、硫酸铵沉淀提取、明矾吸附、超滤浓缩，由此工艺制备出的破伤风抗毒素，规格1500IU/0.75ml/瓶，蛋白含量≤100g/L，制剂中含防腐剂。因此如何克服现有技术的不足是目前医药
亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种无防腐剂的注射用马破伤风免疫球蛋白制剂及其制备方法，该制备方法简单可靠，制得的马破伤风免疫球蛋白F(ab’)2，规格1500IU/0.75ml/瓶，蛋白含量≤50g/L，制剂不含防腐剂，解决了制品去除防腐剂的关键技术要点——大幅降低制品蛋白含量，降低制品本身易受污染程度。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种无防腐剂的注射用马破伤风免疫球蛋白制剂的制备方法，包括如下步骤：步骤（1），提取IgG：常温下操作，马血浆V L，用2V～3V L的质量浓度为0.85%氯化钠水溶液稀释马血浆，得到马血浆稀释液；按马血浆稀释液的体积加入16～18%(m/v)的硫酸铵固体粉末，搅拌至溶解后，静置2～18h，过滤；取滤液，按滤液体积加入13～15%(m/v)硫酸铵固体粉末，接着搅拌至溶解后，静置2～18h，过滤，取沉淀；步骤（2），消化及加温变性：用质量浓度为0.85%氯化钠水溶液溶解步骤（1）得到的沉淀至体积为2V～3V L，用2M盐酸调节pH至2.9～3.3，加入0.06VL胃蛋白酶水溶液，30±1℃保温1.5～2h；所述的胃蛋白酶水溶液浓度为100～170酶单位/ml；之后按步骤（1）得到的沉淀用质量浓度为0.85%氯化钠水溶液溶解后的体积加入14～16%(m/v)硫酸铵固体粉末，搅拌至溶解后，用2M氢氧化钠调节pH至4.9～5.3，58±1℃保温0.5h后降温，待温度降至40℃以下后，过滤，取滤液；步骤（3），提取F(ab’)2：用2M氢氧化钠调节步骤（2）得到的滤液pH至7.0～7.4，然后按滤液体积加入19～21%(m/v)硫酸铵固体粉末，搅拌至溶解后，静置2～18h，过滤，取沉淀；步骤（4），明矾吸附除杂质：将步骤（3）得到的沉淀用注射用水溶解成2V L，然后加入质量浓度为10%的明矾水溶液0.16V L，用2M氢氧化钠调节pH至7.7～7.9，搅拌1h，过滤，取滤液；步骤（5），超滤：将步骤（4）得到的滤液浓缩至0.4V～0.5V L后，利用截留分子大小为50KD的超滤膜进行超滤，超滤时加入缓冲液使超滤罐中液体体积一直维持在0.4V～0.5V L，至超滤罐中液体中硫酸铵含量≤1.0g/L时超滤结束，然后将超滤罐中的溶液浓缩至溶液蛋白含量65～120g/L，即得到超滤浓缩液；所述的缓冲液中PB浓度为0.02M，NaCl浓度为0.01M，pH为6.8～7.2；步骤（6），柱层析纯化：阴离子交换层析柱依次采用3个柱体积水、3个柱体积1M氢氧化钠溶液、3个柱体积水、8～12个柱体积步骤（5）所述的缓冲液进行冲洗；将步骤（5）得到的超滤浓缩液加载至经上述步骤处理后的层析柱中，加载速度为1.0～2.0cm/min，加载完毕用步骤（5）所述的缓冲液冲洗层析柱，当A280nm紫外吸收值开始快速上升时，收集该层析峰液体，得到马破伤风免疫球蛋白F(ab’)2溶液；步骤（7），原液配制：将甘氨酸和氯化钠一起加入到注射用水中溶解，得到第一辅料水溶液；将第一辅料水溶液和步骤（6）所得马破伤风免疫球蛋白F(ab’)2溶液按照体积比为1：10进行混合，混合均匀后，用2M盐酸调节pH至6.0～7.0，除菌过滤后为原液，原液于2～8℃放置稳定；所配制的原液中甘氨酸含量为8～12g/L、氯化钠含量为3.5～6.0g/L；步骤（8），制剂的制备：将甘氨酸和氯化钠一起加入到注射用水中溶解，得到第二辅料水溶液，然后采用第二辅料水溶液对步骤（7）稳定后的原液进行稀释，使马破伤风免疫球蛋白F(ab’)2的含量为2000000～2400000 IU/L、甘氨酸的浓度为8～12g/L、氯化钠的浓度为3.5～6.0g/L；除菌过滤后，分装，得到无防腐剂的注射用马破伤风免疫球蛋白制剂。本专利技术中第一辅料水溶液和第二辅料水溶液中甘氨酸、氯化钠的浓度没有具体要求，只要求保持配制后的液体为上述浓度即可。进一步，优选的是步骤（5）超滤时加入缓冲液的总量为3V～5V L。进一步，优选的是步骤（7）所述的稳定为放置至少1个月。本专利技术所述的马血浆经过以下步骤获得：健康马匹经破伤风类毒素基础免疫，再用破伤风类毒素对基础免疫后的马匹进行超免疫，试血效价达到2500IU/ml以上后，进行马血浆采集。所得马血浆平均效价为3000IU/ml，远远高于国家药典标准1000IU/ml。本专利技术中表示体积时所用的“V”可以为任意数值的体积，没有具体限制。本专利技术还提供一种上述制备方法制备得到的注射用马破伤风免疫球蛋白制剂，其成分为表1所示。表1马破伤风免疫球蛋白F(ab’)2制剂配方本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：1、经本专利技术工艺制备出的破伤风抗毒素更新换代产品——马破伤风免疫球蛋白F(ab’)2，规格1500IU/0.75ml/瓶，蛋白含量≤50g/L，制剂不含防腐剂。解决了制品去除防腐剂的关键技术要点——大幅降低制品蛋白含量，降低制品本身易受污染程度。2、本专利技术工艺经中试规模生产，按本专利技术方法制备出三批制品，经3年稳定性研究考察，制品本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种无防腐剂的注射用马破伤风免疫球蛋白制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），提取IgG：常温下操作，马血浆V L，用2V～3V L的质量浓度为0.85%氯化钠水溶液稀释马血浆，得到马血浆稀释液；按马血浆稀释液的体积加入16～18%(m/v)的硫酸铵固体粉末，搅拌至溶解后，静置2～18h，过滤；取滤液，按滤液体积加入13～15%(m/v)硫酸铵固体粉末，接着搅拌至溶解后，静置2～18h，过滤，取沉淀；步骤（2），消化及加温变性：用质量浓度为0.85%氯化钠水溶液溶解步骤（1）得到的沉淀至体积为2V～3V L，用2M盐酸调节pH至2.9～3.3，加入0.06VL胃蛋白酶水溶液，30±1℃保温1.5～2h；所述的胃蛋白酶水溶液浓度为100～170酶单位/ml；之后按步骤（1）得到的沉淀用质量浓度为0.85%氯化钠水溶液溶解后的体积加入14～16%(m/v)硫酸铵固体粉末，搅拌至溶解后，用2M氢氧化钠调节pH至4.9～5.3，58±1℃保温0.5h后降温，待温度降至40℃以下后，过滤，取滤液；步骤（3），提取F(ab’)2：用2M氢氧化钠调节步骤（2）得到的滤液pH至7.0～7.4，然后按滤液体积加入19～21%(m/v)硫酸铵固体粉末，搅拌至溶解后，静置2～18h，过滤，取沉淀；步骤（4），明矾吸附除杂质：将步骤（3）得到的沉淀用注射用水溶解成2V L，然后加入质量浓度为10%的明矾水溶液0.16V L，用2M氢氧化钠调节pH至7.7～7.9，搅拌1h，过滤，取滤液；步骤（5），超滤：将步骤（4）得到的滤液浓缩至0.4V～0.5V L后，利用截留分子大小为50KD的超滤膜进行超滤，超滤时加入缓冲液使超滤罐中液体体积一直维持在0.4V～0.5V L，至超滤罐中液体中硫酸铵含量≤1.0g/L时超滤结束，然后将超滤罐中的溶液浓缩至溶液蛋白含量65～120g/L，即得到超滤浓缩液；所述的缓冲液中PB浓度为0.02M，NaCl浓度为0.01M，pH为6.8～7.2；步骤（6），柱层析纯化：阴离子交换层析柱依次采用3个柱体积水、3个柱体积1M氢氧化钠溶液、3个柱体积水、8～12个柱体积步骤（5）所述的缓冲液进行冲洗；然后将步骤（5）得到的超滤浓缩液加载至经上述步骤处理后的层析柱中，加载速度为1.0～2.0cm/min，加载完毕用步骤（5）所述的缓冲液冲洗层析柱，当A280nm紫外吸收值开始快速上升时，收集该层析峰液体，得到马破伤风免疫球蛋白F(ab’)2溶液；步骤（7），原液配制：将甘氨酸和氯化钠一起加入到注射用水中溶解，得到第一辅料水溶液；将第一辅料水溶液和步骤（6）所得马破伤风免疫球蛋白F(ab’)2溶液按照体积比为1：10进行混合，混合均匀后，用2M盐酸调节pH至6.0～7.0，除菌过滤后为原液，原液于2～8℃放置稳定；所配制的原液中甘氨酸含量为8～12g/L、氯化钠含量为3.5～6.0g/L；步骤（8），制剂的制备：将甘氨酸和氯化钠一起加入到注射用水中溶解，得到第二辅料水溶液，然后采用第二辅料水溶液对步骤（7）稳定后的原液进行稀释，使马破伤风免疫球蛋白F(ab’)2的含量为2000000～2400000 IU/L、甘氨酸的浓度为8～12g/L、氯化钠的浓度为3.5～6.0g/L；除菌过滤后，分装，得到无防腐剂的注射用马破伤风免疫球蛋白制剂。...
【技术特征摘要】
1.一种无防腐剂的注射用马破伤风免疫球蛋白制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），提取IgG：常温下操作，马血浆V L，用2V～3V L的质量浓度为0.85%氯化钠水溶液稀释马血浆，得到马血浆稀释液；按马血浆稀释液的体积加入16～18%(m/v)的硫酸铵固体粉末，搅拌至溶解后，静置2～18h，过滤；取滤液，按滤液体积加入13～15%(m/v)硫酸铵固体粉末，接着搅拌至溶解后，静置2～18h，过滤，取沉淀；步骤（2），消化及加温变性：用质量浓度为0.85%氯化钠水溶液溶解步骤（1）得到的沉淀至体积为2V～3V L，用2M盐酸调节pH至2.9～3.3，加入0.06VL胃蛋白酶水溶液，30±1℃保温1.5～2h；所述的胃蛋白酶水溶液浓度为100～170酶单位/ml；之后按步骤（1）得到的沉淀用质量浓度为0.85%氯化钠水溶液溶解后的体积加入14～16%(m/v)硫酸铵固体粉末，搅拌至溶解后，用2M氢氧化钠调节pH至4.9～5.3，58±1℃保温0.5h后降温，待温度降至40℃以下后，过滤，取滤液；步骤（3），提取F(ab’)2：用2M氢氧化钠调节步骤（2）得到的滤液pH至7.0～7.4，然后按滤液体积加入19～21%(m/v)硫酸铵固体粉末，搅拌至溶解后，静置2～18h，过滤，取沉淀；步骤（4），明矾吸附除杂质：将步骤（3）得到的沉淀用注射用水溶解成2V L，然后加入质量浓度为10%的明矾水溶液0.16V L，用2M氢氧化钠调节pH至7.7～7.9，搅拌1h，过滤，取滤液；步骤（5），超滤：将步骤（4）得到的滤液浓缩至0.4V～0.5V L后，利用截留分子大小为50KD的超滤膜进行超滤，超滤时加入缓冲液使超滤罐中液体体积一直维持在0.4V～0.5V L，至超滤罐中液体中硫酸铵含量≤1.0g/L时超滤结束，然后将超滤罐中的溶液浓缩至溶液蛋白含量65～120g...
【专利技术属性】
技术研发人员：李景玉，陈孝婷，石碧珠，
申请(专利权)人：玉溪九洲生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南;53
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