用于产生作为与惰性免疫球蛋白Fc区Fc融合的可溶FcR的方法及其用途技术

本文是具有式R1-FC-R2的融合多肽及其用途，其中R1表示第一Fc受体，R2表示第二Fc受体，并且FC表示重链Fc区多肽，其中R1或R2或二者均存在，其中FC基本上不结合R1和/或R2。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生作为与惰性免疫球蛋白Fc区Fc融合的可溶FcR的方法及其用途本文报道用于产生作为与防止自我聚集的惰性免疫球蛋白Fc区的融合多肽的可溶Fc受体的方法及其用途，例如FcR层析柱，测定低亲和力抗体的FcR相互作用。专利技术背景免疫球蛋白一般包含两条轻多肽链和两条重多肽链。每条重多肽链和轻多肽链包含含有能够与抗原相互作用的结合结构域的可变区(通常是多肽链的氨基端部分)。每条重多肽链和轻多肽链还包含恒定区(通常是羧基端部分)。重链的恒定区介导免疫球蛋白与例如具有Fcγ受体(FcγR)的细胞(如吞噬细胞)或与具有新生Fc受体(FcRn)(也称为Brambell受体)的细胞的结合，还介导与一些因子(包括经典补体系统的因子，如(C1q)成分)的结合。Hulett和Hogarth(Hulett,M.D.和Hogarth,P.M.,Adv.Immunol.57(1994)1-127)报道，G类免疫球蛋白的Fc部分的胞外受体是跨膜糖蛋白家族，该家族包含具有不同结合特异性的三种不同受体类型：FcγRI、FcγRII和FcγRIII。I型受体与未复合的IgG相互作用，而II型和III型受体优选与复合的IgG相互作用。人FcγRIII(CD16)以两种同种型和两种多态形式存在。第一同种型FcγRIIIa是由与第二同种型FcγRIIIb不同的基因编码的跨膜分子，所述第二同种型FcγRIIIb是GPI锚定的膜蛋白。多态形式V159在氨基酸序列的159位具有缬氨酸残基而多态形式F159在159位具有苯丙氨酸残基。对于IgG类免疫球蛋白，ADCC和ADCP由Fc区与称为Fc-gamma(Fcγ)受体(FcγR)的受体的家族的参与管控。在人中，此蛋白家族包含FcγRI(CD64)、包括同种型FcγRIIA、FcγRIIB，和FcγRIIC的FcγRII(CD32)，和包括同种型FcγRIIIA和FcγRIIIB的FcγRIII(CD16)(Raghavan和Bjorkman,Annu.Rev.CellDev.Biol.12(1996)181–220；Abes,等人,ExpertReviews(2009)735-747)。FcγR在多种免疫细胞上表达，并且Fc/FcγR复合体的形成将这些细胞招募至结合的抗原的位点，通常导致发信号和随后的免疫应答诸如炎症介质的释放、B细胞激活、内吞作用、吞噬作用，和细胞毒性攻击。此外，尽管FcγRI、FcγRIIA/C，和FcγRIIIA是由基于胞内免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)表征的激活受体，FcγRIIB具有抑制性基序(ITIM)并因此是抑制性的。尽管FcγRI以高亲和力结合单体IgG，FcγRIII和FcγRII是低亲和力受体，与复合的或聚集的IgG相互作用。IgG与激活和抑制性Fcγ受体或补体的第一组分(C1q)的结合取决于位于铰链区和CH2结构域中的残基。CH2结构域的2个区域对于FcγR和补体C1q结合是至关重要的，并且具有独特的序列。替换人IgG1和IgG2第233-236位残基和IgG4第327、330和331位残基大大降低了ADCC和CDC(Armour,等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624；Shields,等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。Idusogie,等人(J.Immunol166(2000)2571-2575)对治疗性抗体Rituxan(R)的C1q结合位点绘图并显示Pro329Ala替换降低了利妥昔单抗(Rituximab)结合C1q和激活补体的能力。已经报道用Ala替换Pro329导致降低的与FcγRI,FcγRIIandFcγRIIIA受体的结合(Shields,等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)但是也已经将此突变描述为表现出与FcγRI和FcγRII的野生型样结合并且与FcγRIIIA受体的结合仅有非常小的降低(EP1068241，Genentech中的表1和表2)。在WO2010/048313中报道了用于纯化含有Fc的融合蛋白的重组FcRn及其变体。Fc-X融合蛋白在哺乳动物细胞中的高水平表达和分泌由Lo等人报道(Lo,K-M.,等人,Prot.Eng.11(1998)495-500)。Dumont,F.A.,等人(Biodrugs20(2006)151-160)报道了单体Fc融合物。受体Fc融合治疗剂，traps,和MIMETIBODYTM技术由Huang,C.(Curr.Opin.Biotechnol.20(2009)592-599)报道。在WO01/03737中报道了免疫球蛋白融合蛋白。WO00/40615中报道了作为Fc融合蛋白表达和输出抗肥胖蛋白。专利技术概述已发现，可以通过将Fc受体表达为具有基本上不结合融合的Fc受体的Fc区的融合多肽生产可溶Fc受体。使用融合多肽来表达Fc受体增加融合多肽形式或作为分离的受体的Fc受体的可获得的产量。此外，本文报道的融合多肽提供用于组合单个分子中的多于一个拷贝的Fc受体，例如用于增加的亲和力，或用于组合单个分子中的不同Fc受体(不同来源或不同类型或上述二者)的增加的灵活性。本文报道的一个方面是根据式I的融合多肽：R1-FC-R2(式I)其中R1表示第一Fc受体，R2表示第二Fc受体，和FC表示重链Fc区多肽，其中R1或R2或二者均存在，其中FC基本上不结合R1和/或R2。在一个实施方案中融合多肽具有式IIR1-CS1-L1-CS2-FC-CS3-L2-CS4-R2(式II)其中R1表示第一Fc受体，R2表示第二Fc受体，FC表示重链Fc区多肽，CS1表示第一切割位点，CS2表示第二切割位点，CS3表示第三切割位点，CS4表示第四切割位点，L1表示第一间插氨基酸序列，和L2表示第二间插氨基酸序列，其中R1或R2或二者均存在，其中CS1、CS2、CS3、CS4中的任一者可以彼此独立地存在或不存在，其中L1和L2可以彼此独立地存在或不存在，其中FC基本上不结合R1和/或R2。在一个实施方案中R1和R2彼此独立地选自人Fcγ受体、人新生Fc受体、鼠Fc受体，和兔新生Fc受体的组。在一个实施方案中人Fcγ受体选自人FcγRI(CD64)、人FcγRII(CD32)、人FcγRIIA、人FcγRIIB、人FcγRIIC、人FcγRIII(CD16)、人FcγRIIIA，和人FcγRIIIB。在一个实施方案中人新生Fc受体是人FcRn。在一个实施方案中鼠Fc受体选自鼠FcγRI(CD64)、鼠FcγRII(CD32)、鼠FcγRIIB、鼠FcγRIII(CD16)、鼠FcγRIII-2(CD16-2)，和鼠FcγRIV。在一个实施方案中Fc是选自人IgG重链多肽、鼠IgG重链多肽、兔IgG重链多肽的组的重链多肽的变体。在一个实施方案中，FC是选自人IgG1重链多肽、人IgG2重链多肽、人IgG3重链多肽、人IgG4重链多肽、鼠IgG1重链多肽、鼠IgG2重链多肽、鼠IgG2a重链多肽、鼠IgG3重链多肽、兔IgG重链多肽的组的重链多肽的变体。在一个实施方案中，重链Fc区多肽在位置234、235、236、237、238本文档来自技高网...

【技术保护点】
根据式I的融合多肽：R1‑FC‑R2(式I)其中R1表示第一Fc受体，R2表示第二Fc受体，和FC表示重链Fc区多肽，其中R1或R2或二者均存在，其中FC基本上不结合R1和/或R2。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.08.02 EP 12179025.71.根据式I的融合多肽：R1-FC-R2(式I)其中R1表示第一Fc受体，R2表示第二Fc受体，和FC表示重链Fc区多肽，其中R1或R2存在，或R1和R2二者均存在，其中FC不结合R1和/或R2，其中R1和R2彼此独立地选自人Fcγ-受体、人新生Fc受体、鼠Fc受体，和兔新生Fc受体的组，和其中FC是突变的人IgG1重链Fc区多肽，其中突变是L234A、L235A、P329G，以及孔突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，或突变是L234A、L235A、P329G，以及结突变T366W和S354C。2.根据权利要求1的融合多肽，其中融合多肽具有式IIR1-CS1-L1-CS2-FC-CS3-L2-CS4-R2(式II)其中R1表示第一Fc受体，R2表示第二Fc受体，FC表示重链Fc区多肽，CS1表示第一切割位点，CS2表示第二切割位点，CS3表示第三切割位点，CS4表示第四切割位点，L1表示第一间插氨基酸序列，和L2表示第二间插氨基酸序列，其中R1或R2存在，或R1和R2二者均存在，其中CS1、CS2、CS3、CS4中的任一者可以彼此独立地存在或不存在，其中L1和L2可以彼此独立地存在或不存在，其中FC不结合R1和/或R2。3.根据权利要求1的融合多肽，其中人Fcγ受体选自人FcγRI(CD64)、人FcγRII(CD32)、人FcγRIIA、人FcγRIIB、人FcγRIIC、人FcγRIII(CD16)、人FcγRIIIA，和人FcγRIIIB。4.根据权利要求3的融合多肽，其中人新生Fc受体是人FcRn。5.根据权利要求1的融合多肽，其中鼠Fc受体选自鼠FcγRI(CD64)、鼠FcγRII(CD32)、鼠FcγRIIB、鼠FcγRIII(CD16)、鼠FcγRIII-2(CD16-2)，和鼠FcγRIV。6.根据权利要求1的融合多肽，其中Fc受体中的一个或多个是Fcγ受体。7.根据权利要求1的融合多肽，其中Fc受体中的一个或多个是FcRn。8.根据权利要求2的融合多肽，其中间插氨基酸序列选自包含(G3S)3、(G3S)4、(G3S)5、(G3S)6、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、(G5S)2、(G5S)3、和(G5S)4的第一组，或选自包含Arg标记、Avi标记、His-Avi标记、His标记、Flag标记、3xFlag标记、Strep标记、Nano标记、SBP标记、c-myc标记、S标记、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标记或MBP标记的第二组，或选自这些组的两个元件的组合。9.根据权利要求2的融合多肽，其中切割位点选自I...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·鲁格尔，T·施洛特豪尔，S·西伯尔，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH