分泌性免疫球蛋白复合物制造技术

本发明专利技术提供一种以为非人分泌物来源的分泌性免疫球蛋白为基础的免疫复合物制剂的生产方法，所述方法包括-提供工业规模的生产体系，能够生产N-糖基化分泌成分，-通过此类体系生产分泌成分，所述分泌成分包括相对于每摩尔分泌成分的至少0.01mol的非核心岩藻糖，和-将所述分泌成分与具有天然糖基化模式的IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一相结合，从而获得免疫复合物。本发明专利技术提供包括氨基酸序列SEQ ID 1或其功能性活性变体的分离的重组分泌成分，所述分离的重组分泌成分具有路易斯型N糖基化模式和相对于每摩尔分泌成分的至少2mol非核心岩藻糖；还提供一种以源自除人分泌物以外来源的分泌性免疫球蛋白为基础的免疫复合物制剂，其包括-分泌成分，所述分泌成分具有路易斯型N糖基化模式和相对于每摩尔分泌成分的至少0.01mol非核心岩藻糖，和-具有天然糖基化模式的IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分泌性免疫球蛋白复合物
本专利技术涉及生产以不源自人乳的分泌性免疫球蛋白为基础的免疫复合物制剂(preparation)的方法、免疫复合物制剂和重组分泌成分。
技术介绍
分泌成分(SecretoryComponent，SC)为分泌性免疫球蛋白(SIgA和SIgM)的成分，包括多聚免疫球蛋白受体(pIgR)的胞外部分。多聚IgA和IgM通过J链介导而在上皮细胞的基底外侧面上结合至多聚免疫球蛋白受体，并且经胞转(transcytosis)吸收至细胞中。受体-免疫球蛋白复合物在分泌至上皮细胞腔表面上之前穿过细胞区室(cellularcompartment)，仍与受体附着。受体的蛋白水解作用发生并且二聚IgA分子或IgM，与分泌成分一起，在整个腔内自由扩散。已记载了分泌成分在各种分泌体如唾液、眼泪、粘液和乳中产生。可作为分泌性免疫球蛋白(SIg，即SIgA和SIgM)的一部分以及游离的分泌成分(fSC)而发现。人分泌成分(hSC)通过在胞转过程中受体分子胞外部分的切割而衍生自多聚免疫球蛋白受体。其具有约80kDa的表观分子量并由排列在五个V型免疫球蛋白结构域中的约前585个氨基酸的pIgR(多聚Ig受体)组成。其具有7个潜在的N-糖基化位点。这种强烈的糖基化作用有助于大的表观分子量。这些聚糖的组成包括二-和三触角结构、路易斯型结构以及半乳糖和唾液酸。这些聚糖构成细菌、病毒、真菌和原生动物结构如黏附素和毒素以及宿主组织上的黏蛋白和受体的结合表位。分泌成分的一项拟议的功能是保护多聚免疫球蛋白免受蛋白降解并结合至与结构相关的病原体和毒素如幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenicE.coli)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)毒素A和肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)胆碱结合蛋白A。SC上的聚糖已证实参与对粘膜病原体的固有保护(Perrier等人，THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRYVol.281(20),pp.14280-14287,2006)。作者报道了由转染的中国仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvarycells,CHO))产生的重组人SC与由人乳纯化的SC表现相同。与病原体抗原的相互作用由存在于hSC上的聚糖介导并涉及半乳糖和唾液酸残基。hSC被认为是有助于保护身体上皮表面的抗病原库(antipathogenicarsenal)的微生物清除剂。发现由人乳纯化的SC竞争性抑制艰难梭菌毒素A结合至受体(Dallas等人，J.Med.Microbiol.47:879-888(1998))。通过酶消化从SIgA和SC除去糖类显示出艰难梭菌毒素A与去糖基化SC的结合比与糖基化SC的结合少。人SC存在大范围的聚糖结构，包括可能结合凝集素和细菌黏附素的所有不同的路易斯和唾液酸化(sialyl)-路易斯表位。人们可发现半乳糖与GlcNAc连接成β1-4和β1-3；岩藻糖与GlcNAc连接成α1-3和α1-4且与半乳糖连接成α1-2，以及α2-3-和α2-6-连接的唾液酸。来自人乳的SC的超过50％的聚糖显示各种类型的非核心岩藻糖基化(non-corefucosylation)，最丰富的含岩藻糖的抗原为路易斯x。人SC中约30％的路易斯型岩藻糖基化抗原被唾液酸化。总之，来自人乳的SC显示超过50种不同的糖型。SC上聚糖的拟议功能为例如·分泌性免疫球蛋白在粘液中锚定的介导，·分泌性免疫球蛋白/抗原复合物与特定受体(如DC-SIGN)结合的介导，·作为结合至宿主细胞的病原体结构的竞争性抑制剂(“诱饵(decoy)”)的作用，例如通过作为由病原体毒素、病毒和细菌表达的凝集素样受体的诱饵而起作用，·分泌性免疫球蛋白和对抗蛋白酶的SC(SCagainstproteases)的保护。天然SC中发现的众多聚糖结构可反映众多功能。然而，对于分泌性免疫球蛋白的特定治疗和预防用途，可有利地减少聚糖种群(population)在分泌性免疫球蛋白制备中的复杂度。对特定聚糖结构和修饰的偏向可增加分泌性免疫球蛋白制剂的效力和/或减少分泌性免疫球蛋白制剂的潜在副反应。人分泌成分已重组表达在各种基因工程生物体和细胞例如细菌(大肠杆菌)、昆虫细胞(Sf9细胞)、哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢细胞、非洲绿猴肾CV-1细胞、人骨肉瘤细胞TK-143B、人HeLa细胞、仓鼠崽肾细胞、人腺癌细胞HT29、小鼠成纤维细胞、马-达二氏犬肾细胞(Madin-Darbycaninekidneycells))和植物(例如US20080260822，EP799310，Michetti等人，1991AdvExpMedBiol,vol310,pp183-5；Suguro等人，2011,ProteinExprPurif.Vol.78,pp143-8；Prinsloo等人，2006ProteinExprPurif.vol47,pp179-85；Ogura,2005,JOralSci.vol47,pp15-20；Matsumoto等人，2003ScandJImmunol.Vol58,pp471-6；Johansen等人，1999EurJImmunol.,Vol29,pp1701-8；Chintalacharuvu和Morrison1999,Immunotechnology.Vol4,pp165-74；deHoop等人，1995.JCellBiol.Vol130,pp1447-59；Larrick等人，2001BiomolEng.Vol18,pp87-94；Berdoz等人，1999,ProcNatlAcadSciUSA.vol96,pp3029-34；Rindisbacher等人，1995,JBiolChemvol.270,pp14220-8)中。发现于重组SC的聚糖模式依赖于宿主物种，宿主有机体(hostorganism)、组织来源，以及基因工程细胞的生理状态。虽然大肠杆菌根本不能产生N-糖基化蛋白，但迄今为止用于表达重组SC的大多数其它宿主不能产生路易斯x岩藻糖基化(Sf9细胞、植物细胞、HeLa、CHO细胞、CV-1细胞、143B细胞、BHK细胞、小鼠成纤维细胞、MDCK细胞)。在所述条件下，HT-29不会有效地在N-聚糖上产生路易斯抗原。在葡萄糖中培养的HT-29细胞具有未分化多能过渡细胞(transitcells)的性质，非常不稳定，然而，在分化非许可条件(HT-29Glc+)下生长的HT-29细胞中高甘露糖向复合物糖蛋白的转化严重减少，而不管研究任何生长阶段。母乳中的糖类表位已知在物种间不同，其中人乳表达最复杂的一种。Gustafsson等人(Glycoconjugate22:109-118(2005))研究了在来自人、牛、山羊、绵羊、猪、马、单峰驼(dromedary)和兔的个体乳样品中的蛋白-结合糖类表位的表达。发现于SC的聚糖模式依赖于宿主物种、宿主有机体、组织来源和生物体的生理状态(如健康状态、泌乳期)。Xu等人(WorldJ.Gastroenterol.10(14)2063-2066(2004))分析了从转基因山羊本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产以分泌性免疫球蛋白为基础的免疫复合物制剂的方法，所述免疫复合物制剂为非人分泌物来源的，所述方法包括‑提供能够生产N‑糖基化分泌成分的工业规模的生产体系，‑通过此类体系生产分泌成分，所述分泌成分包括相对于每摩尔分泌成分为至少0.01mol的非核心岩藻糖，和‑将所述分泌成分与具有天然糖基化模式的IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一相结合，从而获得免疫复合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.05 EP 12163439.81.一种分离的重组的分泌成分的生产方法，其中所述方法包括：通过真核细胞系的表达来获得所述重组的分泌成分，所述真核细胞系表达其中x为2、3或4的异源功能性α-1,x-岩藻糖基转移酶，其中所述重组的分泌成分包括氨基酸序列SEQID1，所述重组的分泌成分具有路易斯型N糖基化模式和相对于每摩尔分泌成分为至少2mol的非核心岩藻糖。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述真核细胞系为中国仓鼠卵巢细胞系。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分泌成分包括唾液酸。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述分泌成分包括相对于每摩尔分泌成分为至少2mol的唾液酸。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分泌成分为非唾液酸化的。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述分泌成分包括相对于每摩尔分泌成分为小于0.1mol的唾液酸。7.一种分离的重组的分泌成分，其通过根据权利要求1-6任一项所述的方法来获得。8.一种免疫复合物制剂的生产方法，其中所述方法包括：将分泌成分与IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一相结合，从而获得所述免疫复合物制剂，其中所述分泌成分为根据权利要求1至6任一项所述的方法制备而得的分离的重组的分泌成分。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述免疫球蛋白为人免疫球蛋白。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述免疫球蛋白为血浆免疫球蛋白。11.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一具有天然糖基化模式。12.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述IgA为...

【专利技术属性】
技术研发人员：戈特弗里德·希姆莱，
申请(专利权)人：戈特弗里德·希姆莱，
类型：发明
国别省市：奥地利;AT