用接头键合对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力的多个结构域之间而成的蛋白质制造技术

【课题】提供了使对含有对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力的结构域的蛋白Ｇ及蛋白Ａ那样的野生型蛋白质以及含有其结构域突变体的突变型蛋白质(改性蛋白质)所具有的免疫球蛋白的Fc区域在中性区域的抗体结合活性提高、进一步、具有与这些蛋白质相比在弱酸性区域的与免疫球蛋白的Fc区域的结合性更加降低的优异pH应答性的新型蛋白质等。【解决手段】前述蛋白质，其是用接头键合对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力的多个结构域之间而成的蛋白质，特征在于该接头的最大限伸长的长度为80Å～240Å。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用接头键合对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力的多个结构域之间而成的蛋白质，特别是特征在于该接头的最大限伸长的长度为约80?～240?的前述蛋白质等。
技术介绍
历来，以抗体为首的蛋白质的纯化是生物化学研究中的重要课题，已知亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等各种技术。亲和层析是利用与目标蛋白质的特异性亲和性而纯化目标蛋白质的方法。该方法能够容易选择性地回收蛋白质，其亲和性非常强，因此为了解离吸附于层析填充剂的蛋白质，一般而言，大多需要用pH2．5左右的酸性缓冲液进行洗脱。在那样的强酸性条件下，容易引起蛋白质的变性等活性降低，要求在更温和的条件下进行纯化。作为来源于链球菌的蛋白质的蛋白G是在链球菌(Streptococcus)属链球菌的细胞膜中存在的膜蛋白质，已知具有对免疫球蛋白G(为抗体中的一种)的Fc区域的特异性结合活性(非专利文献1、专利文献1)。蛋白G是由多个结构域组成的多结构域型膜蛋白质，显示对具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的结合活性(以下，称为“抗体结合活性”)的是其中的一部分的细胞膜外结构域(非专利文献2)。例如在图1中显示的来源于G148株的蛋白G的情况下，显示抗体结合活性的是B1、B2、B3这3个结构域(文献也记作C1、C2、C3结构域)。另外，在GX7805株的蛋白G中存在3个抗体结合结构域，在GX7809的蛋白G中存在2个抗体结合结构域。已知这些均为将近60个氨基酸的小型蛋白质，在其氨基酸序列之间显示了高同一性)。另外已知，即使切断蛋白G而单独分离各结构域，仍保持抗体结合活性(非专利文献3)。对于蛋白G的细胞膜外结构域而言，现在，利用其选择性的抗体结合活性的多种含有蛋白G细胞膜外结构域的制品(例如，用于抗体纯化的亲和层析用载体(专利文献3、4)、用于检测抗体的检查试剂、研究试剂等)已上市。已知蛋白G的细胞膜外结构域和抗体的结合力在中性～弱酸性区域高，在强酸性区域低(非专利文献4)。所以，当以抗体的分离、回收、纯化为目的时，首先，使血清等的含有抗体的样品溶液处于中性状态，使其接触固定化蛋白G的细胞膜外结构域的珠等的水不溶性的固相支持体，选择性地吸附抗体。此后，用中性～弱酸溶液(pH5～8)清洗而除去抗体以外的成分。最后，通常添加pH2.4～3.5的强酸性溶液而使抗体从固定化的蛋白G脱离，与强酸性溶液一同洗脱(专利文献3)。由此，可以高纯度分离、回收、纯化抗体。然而，抗体置于pH2.4～3.5的强酸性溶液的话会因变性凝集等而劣化，根据抗体的种类的不同，有时还会丧失原本的功能(非专利文献4)。为了防止这些情况，尝试在比pH2.4～3.5更高的pH的弱酸性区域进行处理，但由于蛋白G的细胞膜外结构域和抗体的结合力强，在弱酸性区域抗体不从蛋白G洗脱，得不到足够的回收量。另一方面，已知蛋白G细胞膜外结构域还与Fab结合(非专利文献2)、一个抗体分子可在Fc区域和Fab区域这2个区域与蛋白G细胞膜外结构域结合。变成这样的结合状态时，抗体和蛋白G的细胞膜外结构域不能容易地解离，难以回收抗体。至今本专利技术人等开发了由具有热稳定性、对变性剂的化学稳定性、及对蛋白质分解酶的抗性等(将这些特性总称，也简称为“蛋白质稳定性”)的蛋白G的细胞膜外结构域突变体组成的改性蛋白质(专利文献5及专利文献6)、进而也开发了在弱酸性区域的和免疫球蛋白的Fc区域的结合性和/或同Fab区域的结合性降低的改性蛋白质(专利文献7)。然而，这些改性蛋白质均仅含有显示抗体结合活性的1个结构域。进一步，本专利技术人等开发了由上述改性蛋白质的串联型多聚体组成的蛋白质(专利文献8)。对于这样的蛋白质，与野生型的蛋白G?B1结构域的串联型多聚体相比，与IgG1及IgG3这样的不同亚类的人免疫球蛋白G的Fc区域的在弱酸性区域的结合性更大降低，在填充了含有该蛋白质的本专利技术的捕获剂的蛋白质分离纯化用层析用柱中，能够在弱酸性区域(pH4～5左右)以不变性的状态更容易地洗脱捕获的人免疫球蛋白G。另外，作为来源于金黄色葡萄球菌的蛋白质的蛋白Ａ已知具有对免疫球蛋白Ｇ(为抗体的一种)的Fc区域的特异性结合活性(非专利文献5、非专利文献6)。蛋白A是由多个结构域组成的多结构域型膜蛋白质，显示对具有免疫球蛋白Ｇ的Fc区域的蛋白质的结合活性(以下称为抗体结合活性)的是其中的一部分的细胞膜外结构域(非专利文献6)。例如，在来源于NCTC8325株的蛋白Ａ的情况下，显示抗体结合活性的是E、D、A、B、C这5个结构域。这些是将近60个氨基酸的小型蛋白质，在其氨基酸序列之间显示了高同一性。另外，已知即使切断蛋白Ａ而单独分离各结构域，仍保持抗体结合活性(非专利文献7)。另一方面，Ｚ结构域是基于Ｂ结构域的序列合成的人工蛋白质(非专利文献7)，与Ｂ结构域相差2个氨基酸残基。已知利用其Ala1Val和Gly29Ala这2个取代，不会丧失抗体结合性且结构稳定化，其热变性温度变为90℃以上(非专利文献7)。对于蛋白A的细胞膜外结构域(E、D、A、B、C)及Z结构域而言，现在已上市利用其选择性的抗体结合活性的多种制品(例如，用于抗体纯化的亲和层析用载体、用于检测抗体的检查试剂、研究试剂等)。已知蛋白Ａ的细胞膜外结构域和抗体的结合力在中性区域高，在强酸性区域低(非专利文献8)。所以，以抗体的分离、回收、纯化作为目的时，首先，使血清等含有抗体的样品溶液处于中性状态，使其接触到固定化蛋白Ａ的细胞膜外结构域的珠等的水不溶性的固相支持体，选择性地吸附抗体。此后，用pH7的中性溶液清洗而除去抗体以外的成分。最后，通常添加pH3.0的强酸性溶液而使抗体从固定化的蛋白Ａ解吸，与强酸性溶液一同洗脱。由此，可以高纯度分离、回收、纯化抗体。关于蛋白A，本专利技术人等至今开发了在弱酸性区域的易解离性提高的含有蛋白Ａ的细胞膜外结构域突变体的突变型蛋白质及抗体互补剂(专利文献9)以及在酸性区域的亲和性降低的含有蛋白A的细胞膜外结构域突变体的突变型蛋白质及抗体互补剂(专利文献10)。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表平03－501801公报专利文献2：日本专利第2764021号公报专利文献3：日本特开平03－128400号公报专利文献4：日本特开2003－088381号公报专利文献5：日本特开2009-95322号公报专利文献6：日本特开2009-118749号公报专利文献7：日本特开2009-297018号公报专利文献8：国际公开第2013/01888本文档来自技高网...

【技术保护点】
用接头键合对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力的多个结构域之间而成的蛋白质，其特征在于，该接头的最大限伸长的长度为80Å～240Å。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.04 JP 2013-2094271.用接头键合对具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分的蛋白质具有亲和力的多个结构域
之间而成的蛋白质，其特征在于，该接头的最大限伸长的长度为80?～240?。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中接头为多肽接头。
3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，接头由22～66个氨基酸残基的多肽组
成。
4.根据权利要求3所述的蛋白质，其中接头的氨基酸序列由GlyGlySerGlyGlySer的4～
10个重复单位组成。
5.根据权利要求4所述的蛋白质，其中接头的氨基酸序列由GlyGlySerGlyGlySer的6～
10个重复单位组成。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的蛋白质，其中结构域来源于蛋白G或蛋白A。
7.根据权利要求6所述的蛋白质，其中结构域为野生型蛋白G?B1、B2、或B3结构域中任
一个的突变体。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的蛋白质，其中结构域彼此相同。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的蛋白质，其中2个结构域是键合而成的二聚体。
10.根据权利要求7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋
白质：
野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(a)所示的氨基酸序列组
成，或由在(a)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸
序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B1结构域蛋白
质相比，至少对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活
性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、
或Leu，X47表示Asp或Pro，X48表示Ala、Lys或Glu，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32
表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile，
但是，排除同时地X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或Leu、X47是Asp或Pro、X48是
Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr、并且X17是
Thr的情况)。
11.根据权利要求7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋
白质：
野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(b)所示的氨基酸序列组
成，或由在(b)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸
序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B2结构域蛋白
质相比，至少对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活
性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、
或Leu，X47表示Asp或Pro，X48表示Ala、Lys或Glu，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32
表示Gln或His，X40表示Asp或His，X42表示Glu或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile，
但是，排除同时地X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或His、X47是Asp或Pro、X48是
Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr、并且X17是
Thr的情况)。
12.根据权利要求7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋
白质：
野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(c)所示的氨基酸序列组
成，或由在(c)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸
序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且与野生型蛋白G·B3结构域蛋白
质相比，至少对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活
性降低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、
或Leu，X47表示Asp或Pro，X48表示Ala、Lys或Glu、X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32
表示Gln或His，X40表示Asp或His，X11表示Thr或Arg，X17表示Thr或Ile，但是，排除同时地
X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或His、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、
X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X11是Thr、并且X17是Thr的情况)。
13.根据权利要求7～9中任一项所述的蛋白质，其中结构域突变体是以下的突变体蛋
白质：
野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，其由以下的(d)所示的氨基酸序列组
成，或由在(d)所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、取代、插入或添加的氨基酸
序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且，与野生型蛋白G·B1结构域蛋白
质相比，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降
低：
(上述氨基酸序列中，各自地，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gln或His，

【专利技术属性】
技术研发人员：本田真也，渡边秀树，吉田昼也，矶部丰，上田桃子，中井康人，
申请(专利权)人：独立行政法人产业技术综合研究所，株式会社大赛璐，
类型：发明
国别省市：日本;JP