一种抗手足口病人免疫球蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种抗手足口病人免疫球蛋白及其制备方法，其手足口病毒中和抗体效价大于等于1:800。该制备方法包括：(1)筛选出手足口病毒中和抗体效价大于等于1:80的高效特免血浆；(2)将筛选出的高效特免血浆混合；(3)将上述混合血浆采用低温乙醇压滤法分离并结离子交换层析法纯化分离免疫球蛋白组分Ⅱ，经过滤、层析、超滤、配制、低pH孵放灭活病毒、纳米膜过滤去除病毒、分装得到纯度98.5％～100％的免疫球蛋白。该制备和生产方法得到的手足口人免疫球蛋白抗体效价、纯度和回收率高，可以针对性的对肠道病毒进行治疗，是治疗肠道病毒感染症的有效药物，安全可靠，具有较大的社会效益和经济效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物制药领域的治疗用血液制品，特别是涉及一种抗手足口病人免疫球蛋白及其制备方法。
技术介绍
EV71病毒属于微小病毒科肠道病毒属，为单股正链RNA病毒,主要由柯萨奇病毒(Cox)、埃可病毒(Echo)、肠道型病毒71型(EV71)中的一种或几种引起。该病早期病原体主要为CoxA16型。1969年，研究者首次从患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离得到肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)。1974年以来，EV71病毒曾在世界范围内多次暴发，主要引起婴幼儿(0～6岁)手足口病(HFMD)和无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种与神经系统相关的疾病，而中枢神经系统感染导致的肺水肿、肺出血和心肌炎，使其致残和病死率较高。每次疫情暴发，均会夺走许多婴幼儿的生命。1997年以来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势。1981年，我国在上海发现手足口病，随后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、广东和安徽等十几个省(市)相继出现疫情。2008年EV71导致的手足口病疫情在多个省市暴发，2009年1～4月，全国累计报告手足口病例115618例，重症773例，死亡50例，由于死亡的都是婴幼儿，引起很大的社会恐慌。到目前为止，临床上尚无预防EV71病毒感染的疫苗或特异、高效的抗病毒治疗药物，静脉注射人免疫球蛋白(IVIG)能有效地抵抗炎症的发生发展，对感染手足口病的患者有一定的治疗作用，但特异性不强。因此开发具有特异性的针对手足口病毒的人免疫球蛋白具有重要的意义，对于治疗因巨细胞病毒引起的重症感染具有不可替代的临床应用价值。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种有效治疗手足口病毒重症感染的人免疫球蛋白及其制备方法，使其应用于工业化生产，且产品高效、安全、可靠。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种抗手足口病人免疫球蛋白,其手足口病人免疫球蛋白中和抗体效价大于等于1∶800。所述免疫球蛋白与正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀线为IgG。所述免疫球蛋白的纯度为98.5％～100％。所述免疫球蛋白的单体和二聚体之和达到99％～99.5％，PKA≤30IU/mL，ACA≤45％。其中，PKA指激肽释放酶原激活剂，ACA指抗补体活性。本专利技术所述的抗手足口病人免疫球蛋白具有高效、安全、可靠、特异性强等优点，可以用于大规模的工业化生产。制备所述免疫球蛋白的原料血浆为肠道病毒抗体效价不低于1∶80的血浆。本专利技术所述的抗手足口病人免疫球蛋白可以根据实际需要选择合适的剂型，例如液体制剂或冻干制剂；具体使用时，可以采用静注或其他的方式。本专利技术还提供一种抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)用中和试验的方法筛选出手足口病毒不低于1:80中和抗体效价滴度的原料血浆；(2)以筛选后的所述原料血浆制备混合血浆供试品，所述混合血浆中手足口病毒中和抗体效价滴度不低于1:160；(3)将所述混合血浆供试品采用低温乙醇压滤法分离结合层析法纯化生产人免疫球蛋白，生产操作压力为0.05～0.3MPa，主要包括从血浆中分离组分II+III沉淀、从组分II+III中分离组分II、层析、超滤、病毒灭活、配置、分装得到产品。进一步，步骤(1)所述中和试验法具体步骤包括如下：(A)样品稀释：血浆样本用细胞维持液预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，后继续10倍稀释，即最终1:40倍稀释的样品液；打开足够量的96孔细胞板，标明病毒回滴用板和样品试验板，并在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒性型号和代次；在样品试验板的各样品孔中加入25μL细胞维持液,病毒回滴孔与阴性对照孔加入50μL细胞维持液；将预先灭活的样品液分别加入到96孔细胞板的相应位置，每孔加样品25μL，每样品作竖向两孔平行；所述细胞维持液为体积比为3％的胎牛血清的DMEM液；(B)攻击病毒：攻击病毒液制备：根据试验的标本数用维持液制备足量的攻击病毒液，将病毒稀释到100CCID50/0.05mL；除病毒回滴孔与阴性对照孔外，其余各孔中均加入50μL含100CCID50的攻击病毒液；回滴100CCID50攻击病毒液：用细胞维持液将攻击病毒液作10-1、10-2、10-3稀释，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液分别加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，每个稀释度加10孔，50μL/孔；阴性对照：向阴性对照各孔中再加入50μL细胞维持液；将所有96孔细胞板放入37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中和培养2小时；(C)细胞悬液的配制与添加：细胞悬液的配制：取足够量的RD细胞，消化后计数，稀释至试验所需的细胞液量，试验用细胞悬液浓应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用；细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；(D)培养及观察统计：将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养7天，病毒接种后的第5天显微镜下观察细胞生长情况，第7天最终判定结果，并记录统计。进一步，步骤(3)所述免疫球蛋白制备具体步骤包括如下：(A)从血浆中分离组分II+III：将冷冻血浆在温度在1～4℃之间融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到6.9～7.3，加入浓度为54％的乙醇，使血浆中乙醇的最终浓度为8％～10％，使反应液的最终温度为-1～-4℃，离心分离组分I；用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到5.85～6.05，加入浓度为95％的乙醇，使血浆中乙醇的浓度从8％达到20％，使反应液的最终温度控制在-3.0℃～-5.0℃，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀；(B)将上步加压过滤后的组分II+III沉淀用加入4～6倍量预冷的注射用水溶解，使反应温度控制在0～2.0℃。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.05～5.25，加入浓度为95％的乙醇，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-4.5℃～-5.5℃，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液；向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.2～7.6，每升溶液加入2.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗手足口病人免疫球蛋白,其特征在于，其手足口病人免疫球蛋白中和抗体效价大于等于1∶800。

【技术特征摘要】
1.一种抗手足口病人免疫球蛋白,其特征在于，其手足口病人免疫球蛋
白中和抗体效价大于等于1∶800。
2.根据权利要求1所述一种抗手足口病人免疫球蛋白,其特征在于，所
述免疫球蛋白与正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀线为IgG。
3.根据权利要求1所述一种抗手足口病人免疫球蛋白,其特征在于，所
述免疫球蛋白的纯度为98.5％～100％。
4.根据权利要求1所述一种抗手足口病人免疫球蛋白,其特征在于，所
述免疫球蛋白的单体和二聚体之和达到99％～99.5％，PKA≤30IU/mL，
ACA≤45％。
5.根据权利要求1所述一种抗手足口病人免疫球蛋白,其特征在于，制
备所述免疫球蛋白的原料血浆为肠道病毒抗体效价不低于1∶80的血浆。
6.根据权利要求1-5任一项所述一种抗手足口病人免疫球蛋白,其特征
在于，所述免疫球蛋白的剂型为液体制剂或冻干制剂。
7.一种抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下
步骤：
(1)用中和试验的方法筛选出手足口病毒不低于1:80中和抗体效价
滴度的原料血浆；
(2)以筛选后的所述原料血浆制备混合血浆供试品，所述混合血浆中
手足口病毒中和抗体效价滴度不低于1:160；
(3)将所述混合血浆供试品采用低温乙醇压滤法分离结合层析法纯化
生产人免疫球蛋白，生产操作压力为0.05～0.3MPa，主要包括从血浆中分离
组分II+III沉淀、从组分II+III中分离组分II、层析、超滤、病毒灭活、
配置、分装得到产品。
8.根据权利要求7一种抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法，其特征
在于，步骤(1)所述中和试验法具体步骤包括如下：
(A)样品稀释：
血浆样本用细胞维持液预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，后
继续10倍稀释，即最终1:40倍稀释的样品液；
打开足够量的96孔细胞板，标明病毒回滴用板和样品试验板，并在各
样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒性型号和代次；
在样品试验板的各样品孔中加入25μL细胞维持液,病毒回滴孔与阴性
对照孔加入50μL细胞维持液；
将预先灭活的样品液分别加入到96孔细胞板的相应位置，每孔加样品
25μL，每样品作竖向两孔平行；所述细胞维持液为体积比为3％的胎牛血清
的DMEM液；
(B)攻击病毒：
攻击病毒液制备：根据试验的标本数用维持液制备足量的攻击病毒液，
将病毒稀释到100CCID50/0.05mL；除病毒回滴孔与阴性对照孔外，其余各孔
中均加入50μL含100CCID50的攻击病毒液；
回滴100CCID50攻击病毒液：用细胞维持液将攻击病毒液作10-1、10-2、
10-3稀释，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液分别加入
到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，每个稀释度加10孔，50μL/孔；
阴性对照：向阴性对照各孔中再加入50μL细胞维持液；
将所有96孔细胞板放入37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中
和培养2小时；
(C)细胞悬液的配制与添加：
细胞悬液的配制：取足够量的RD(人横纹肌瘤细胞)细胞，消化后计数，
稀释至试验所需的细胞液量，试验用细胞悬液浓应为1×105个/mL，配好的

\t细胞液立即使用；
细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；
(D)培养及观察统计：
将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的
培养箱中培养7天，病毒接种后的第5天显微镜下观察细胞生长情况，第7
天最终判定结果，并记录统计。
9.根据权利要求7一种抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫磊，李常禄，杨金平，于引航，陈东明，杨莉，孙晓东，孙婷，
申请(专利权)人：哈尔滨派斯菲科生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23