一种冻干型人凝血因子VIII的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种冻干型人凝血因子VIII制备方法，包括以下步骤：采集血浆和速冻血浆；融浆和分离冷沉淀；冷沉淀溶解；酸沉淀；凝胶吸附；S/D病毒灭活；阴离子交换层析；超滤；配制半成品；除菌，分装；冻干；干热病毒灭活。本发明专利技术所述制备方法，产品复融时间短，比活性高，质量稳定，操作简单，产业化后能够极大提升血浆资源利用率，增加市场供应，缓解国内市场FVIII用药紧张的局面。

【技术实现步骤摘要】
一种冻干型人凝血因子VIII的制备方法
本专利技术涉及生物制药领域，特别是涉及一种冻干型人凝血因子VIII的制备方法。
技术介绍
血液制品中血浆蛋白缺乏导致的疾病，如血友病是一种由于患者缺乏凝血因子而导致身体非正常出血，并危及内脏各个器官甚至生命安全的血液系统疾病。人凝血因子Ⅷ(FⅧ)是临床上应用最为普遍的凝血因子类产品之一，主要用于缺乏FⅧ所致的凝血机能障碍，防治甲型血友病和获得性FⅧ缺乏而导致的出血症状及这类病人的手术出血治疗。血友病人只要获得注射FⅧ就可以像正常人一样生活，因此“人凝血因子Ⅷ”被形象的称为血友病患者的“粮食”。人凝血因子Ⅷ产品的研制，将众多血浆捐献者的血浆组分转化成血友病患者的救命药，造福众多甲型血友病患者，免受因Ⅷ因子缺乏导致的关节及全身出血、关节变型等导致的残疾，使他们象常人一样工作生活，因此该专利技术项目具有良好的社会效益。国内能够生产人凝血因子VIII产品的血液制品公司数量有限，并且于血浆资源的严重不足和科研技术的落后，国内FⅧ的临床供应长久以来一直存在巨大缺口，我国能接受正规治疗的血友病患者不到10％。随着人民生活水平的提高及检测筛选的普及，巨大的市场缺口短期难以弥补。目前市售的人凝血因子Ⅷ制剂存在比活性低、存在过多的外源污染物质影响制品安全性问题。大多工艺采用氢氧化铝吸附、PEG沉淀的方法进行制备，如CN20140496187.9《一种人凝血因子VIII的制备方法》，采用Al(OH)3凝胶进行吸附，造成制品中含有Al3+离子的残留，影响制品的安全性，同时存在稳定性差、复溶时间长、比活性低、损失率高的问题。面对目前国内人凝血因子VIII市场供应不足的问题，同时开发复溶时间短，比活性高和收率高的人凝血因子VIII的制备方法具有重要的意义。
技术实现思路
针对以上问题，为了提升人凝血因子VIII的内在质量和收率，本专利技术公开了一种冻干型人凝血因子VIII的制备方法。本专利技术得到的最终产品复融时间短，不高于1min；比活性高，不低于40IU/mg,冻干后外观均一、稳定。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：本专利技术提供一种冻干型人凝血因子VIII制备方法，包括以下步骤：(1)采集血浆和速冻血浆；(2)融浆和分离冷沉淀，得到人凝血因子VIII的原料；(3)冷沉淀溶解：将步骤(2)得到的冷沉淀溶解，调整pH；(4)酸沉淀，离心，得到上清液；(5)凝胶吸附：将步骤(4)离心后的上清液，用氢氧化钠缓冲液调整pH，然后加入DEAESephadexTMA-50凝胶吸附，吸附后用滤芯过滤得到滤液A；(6)S/D病毒灭活，得到病毒灭活液；(7)阴离子交换层析：用将步骤(6)得到的病毒灭活液用EMD-TMAE凝胶进行阴离子交换层析，平衡、上样、再平衡、洗涤和洗脱，得到洗脱液；(8)超滤，得到超滤终浓缩液；(9)配制半成品：向步骤(8)得到的超滤浓缩液中加入透析液调节VIII因子效价，得到半成品；(10)除菌，分装；(11)冻干；(12)干热病毒灭活。本专利技术的有益效果包括：本专利技术所述冻干型人凝血因子VIII的制备方法，包括以下步骤：从人血浆中离心分离冷沉淀溶解；向溶解液中加入醋酸缓冲液进行酸沉淀并离心；加入DEAESephadexTMA-50凝胶吸附II、VII、IX和X因子；采用S/D病毒灭活法灭活病毒；经凝胶EMD-TMAE进行阴离子交换层析；超滤透析浓缩；经配制、除菌分装，冻干，轧盖，干热灭活得到产品。本专利技术所述方法采用酸沉淀结合DEAESephadexTMA-50凝胶吸附的方法代替传统的Al(OH)3吸附和PEG沉淀法，能有效吸附去除VIII因子以外的其他凝血因子，提高VIII因子的纯度和比活，以及结合EMD-TMAE阴离子交换层析，能进一步对FVIII进行纯化提升其内在质量。复融时间短，不高于1min；比活性高，不低于40IU/mg,冻干后外观均一、稳定。本专利技术制备方法简单，产品质量稳定，产业化后能够极大提升血浆资源利用率，增加市场供应，缓解国内市场FVIII用药紧张的局面。进一步，步骤(11)冻干的方法包括以下步骤：将分装后的制品进行预冻、升华、解析干燥，其中：预冻：制品转入冻干机后将产品架设定在5℃保持2-3小时，产品架设定在-5℃保持1小时，产品架设定在-48～-50℃保持1-2小时，升温产品架至-20℃保持1小时，将产品架设定在-48到-50℃保持2.5-4小时，制品温度达到零下-35℃以下；当制冷冷凝器-50℃后开启真空泵组抽真空达≤15帕以下；升华：真空稳定后，设定产品架温度在-25℃～-20℃干燥15小时后逐渐升温产品架到设定温产0℃保持1小时，经2小时升温把产品架升温至设定温度15℃；解析干燥：在观察冻干机视窗产品水线已消失后，进一步提高产品架温度，使产品架30-34℃保持，期间制品均达28℃或以上继续干燥10-12小时，保温后逐渐抽最高真空；升华过程中制品温度不得超过35℃，干燥全程真空≤20Pa。采用上述进一步方案的有益效果是：本专利技术中的冻干工艺的条件设置预冻、一次干燥和解析干燥的时间，使其人凝血因子VIII的冻干时间为3天，制品稳定，外观均一，复融时间短为不高于1min，解决了传统的冻干时间长，冻干形状差，复融时间长和稳定性差等问题。在预冻部分，产品架5℃保持2-3小时，产品架-5℃保持1小时，是为了制品在预冻初期制品的状态能够稳定均一。产品架-48～-50℃保持1-2小时，升温产品架-20℃保持1小时。这是应用了淬火工艺，初期快速的降温可使得制品快速的度过亚稳定状态，后用淬火工艺进行升温，可使得制品晶体增长，扩大升华孔道减小升华阻力，进而缩短了冻干时间。将产品架设定在-48到-50℃保持2.5-4小时，制品温度达到零下-35℃以下是为了使制品快速的冻结并保持一段时间稳固其结构。通过对升华过程中参数的严格控制，使在升华初期让制品处于一个较低的温度升华，抽干大部分水份后逐渐升温产品架可以稳定并且快速的使制品的含水量达到10％左右。解析干燥部分：解析干燥是因为一次升华结束后，还残存了一部分吸附水和结合水，这些水是未冻结的，在一次升华中无法完全除去。这部分水达到一定量时会为微生物繁殖和某些变化反应提供条件，同时使制品不稳定。为了改善产品稳定性，延长保存期，需去除这些残存的水分，我们使产品架30-34℃保持，期间制品均达28℃或28℃以上并继续干燥10-12小时，保温后逐渐抽最高真空，通过将产品架温度设定较高些的温度可以使制品的水分含水量迅速到达国家要求的3％以下。进一步，步骤(5)凝胶吸附的方法包括以下步骤：将步骤(4)离心后的上清液，用0.1M氢氧化钠缓冲液调整pH至6.0～7.0；然后加入DEAESephadexTMA-50凝胶吸附，吸附后用1.2+0.5μm或0.45μm滤芯过滤去除吸附后凝胶得到滤液A。采用上述进一步方案的有益效果是：专利技术人在研究中发现本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种冻干型人凝血因子VIII制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)采集血浆和速冻血浆；/n(2)融浆和分离冷沉淀，得到人凝血因子VIII的原料；/n(3)冷沉淀溶解：将步骤(2)得到的冷沉淀溶解，调整pH；/n(4)酸沉淀，离心，得到上清液；/n(5)凝胶吸附：将步骤(4)离心后的上清液，用氢氧化钠缓冲液调整pH，然后加入DEAESephadexTM A-50凝胶吸附，吸附后用滤芯过滤得到滤液A；/n(6)S/D病毒灭活，得到病毒灭活液；/n(7)阴离子交换层析：用将步骤(6)得到的病毒灭活液用

【技术特征摘要】
1.一种冻干型人凝血因子VIII制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集血浆和速冻血浆；
(2)融浆和分离冷沉淀，得到人凝血因子VIII的原料；
(3)冷沉淀溶解：将步骤(2)得到的冷沉淀溶解，调整pH；
(4)酸沉淀，离心，得到上清液；
(5)凝胶吸附：将步骤(4)离心后的上清液，用氢氧化钠缓冲液调整pH，然后加入DEAESephadexTMA-50凝胶吸附，吸附后用滤芯过滤得到滤液A；
(6)S/D病毒灭活，得到病毒灭活液；
(7)阴离子交换层析：用将步骤(6)得到的病毒灭活液用EMD-TMAE凝胶进行阴离子交换层析，平衡、上样、再平衡、洗涤和洗脱，得到洗脱液；
(8)超滤，得到超滤终浓缩液；
(9)配制半成品：向步骤(8)得到的超滤浓缩液中加入透析液调节VIII因子效价，得到半成品；
(10)除菌，分装；
(11)冻干；
(12)干热病毒灭活。


2.根据权利要求1所述一种冻干型人凝血因子VIII制备方法，其特征在于，步骤(11)冻干的方法包括以下步骤：将分装后的制品进行预冻、升华、解析干燥，其中：
预冻：制品转入冻干机后将产品架设定在5℃保持2-3小时，产品架设定在-5℃保持1小时，产品架设定在-48～-50℃保持1-2小时，升温产品架至-20℃保持1小时，将产品架设定在-48到-50℃保持2.5-4小时，制品温度达到零下-35℃以下；当制冷冷凝器-50℃后开启真空泵组抽真空达≤15帕以下；
升华：真空稳定后，设定产品架温度在-25℃～-20℃干燥15小时后逐渐升温产品架到设定温产0℃保持1小时，经2小时升温把产品架升温至设定温度15℃；
解析干燥：在观察冻干机视窗产品水线已消失后，进一步提高产品架温度，使产品架30-34℃保持，期间制品均达28℃或以上继续干燥10-12小时，保温后逐渐抽最高真空；
升华过程中制品温度不得超过35℃，干燥全程真空≤20Pa。


3.根据权利要求1所述一种冻干型人凝血因子VIII制备方法，其特征在于，步骤(5)凝胶吸附的方法包括以下步骤：将步骤(4)离心后的上清液，用0.1M氢氧化钠缓冲液调整pH至6.0～7.0；然后加入DEAESephadexTMA-50凝胶吸附，吸附后用1.2+0.5μm或0.45μm滤芯过滤去除吸附后凝胶得到滤液A。


4.根据权利要求1所述一种冻干型人凝血因子VIII制备方法，其特征在于，步骤(7)阴离子交换层析的方法包括以下步骤：用将步骤(6)得到的病毒灭活液用EMD-TMAE凝胶进行阴离子交换层析，平衡、上样、再平衡、洗涤和洗脱，其中；
平衡：用平衡液平衡凝胶至流穿液的pH6.50～7.50，其中平衡液的温度10.0～20.0℃，平衡流速为1.3～2.5cm/min；
上样：样品流速控制在0.6～1.4cm/min进行上样，样品温度控制在10.0～20.0℃；
再平衡：上样结束后用3～5倍柱体积的平衡液进行平衡，其中平衡液的温度10.0～20.0℃，平衡流速为0.3～1.5cm/min；
洗涤：用3～8倍柱体积的洗涤液洗涤层析柱至紫外UV280检测值为0.1～3.5mAU，其中洗涤液的温度10.0～20.0℃，流速为1.2～2.5cm/min；
洗脱：用3～5倍柱体积的洗脱液洗脱层析柱上吸附的目标蛋白并进行收集，至紫外UV280检测值为＜0.1mAU时停止收集，其中洗脱液的温度10.0～20.0℃，流速为0.5～2.0cm/min。


5.根据权利要求1所述一种冻干型人凝血因子VIII制备方法，其特征在于，步骤(8)超滤的方法包括以下步骤：将步骤(7)所得到的洗脱液经超滤初浓缩，恒体透析，超滤终浓缩，其中：
初浓缩：用30～50KD的膜包对步骤(7)所得到的洗脱液浓缩至冷沉淀重量的0.10～0.20倍，初浓缩过程中控制药液温度在5.0℃～15.0℃；
恒体积透析：用30～50KD的膜包和透析液对初浓缩的药液进行恒等体积透析至药液电导6～11mS/cm时停止，恒体积透析过程中控制药液温度在5.0℃～15.0℃；
终浓缩：用30～50KD的膜包将药液浓缩至冷沉淀重量的0.05～0.15倍，超滤终浓缩过程中控制药液温度在5.0℃～15.0℃。


6.根据权利要求1-5任一项所述一种冻干型人凝血因子VIII制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集血浆和速冻血浆；
(2)融浆和分离冷沉淀：将速冻后的血浆预融，预融时间为1～2小时；之后融浆；融浆后离心分离，转速为5000～5600rpm，离心机的进液量为900～1100L/min，得到冷沉淀和上清液，冷沉淀即为VIII因子的原料；
(3)冷沉淀溶解：将步骤(2)得到的冷沉淀用3～6倍的注射用水溶解，每公斤注射用水加入4000IU肝素钠，溶解温度控制在15.0℃～30.0℃，溶解时间控制在1～3h，溶解后用0.1M醋酸缓冲液调整pH6.5～7.5；
(4)酸沉淀：将步骤(3)的冷沉淀溶解液降温至5.0℃～15.0℃，并加入0.1M醋酸缓冲液调整pH至5.5～6.5，并进行离心分离，离心转速为6000～6500rpm，离心机的进液量为300～800L/min，得到并收集离心上清液；
(5)凝胶吸附：将步骤(4)离心后的上清液，用0.1M氢氧化钠缓冲液调整pH至6.0～7.0；然后加入DEAESephadexTMA-50凝胶吸附，吸附后用1.2+0.5μm或0.45μm滤芯过滤去除吸附后凝胶得到滤液A；
(6)S/D病毒灭活：向步骤(5)得到的滤液A中加入S/D液进行病毒灭活，灭活温度控制在24.0℃～26.0℃并保温6h，得到病毒灭活液；
(7)阴离子交换层析：用将步骤(6)得到的病毒灭活液用EMD-TMAE凝胶进行阴离子交换层析，平衡、上样、再平衡、洗涤和洗脱，其中；
平衡：用平衡液平衡凝胶至流穿液的pH6.50～7.50，其中平衡液的温度10...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨莉，于引航，闫磊，郝斌，孙婷，樊祥彬，杨永碧，
申请(专利权)人：哈尔滨派斯菲科生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23