一种静注巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种静注巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法，其巨细胞病毒中和抗体效价大于等于1:500。该制备方法包括：(1)筛选出巨细胞病毒中和抗体效价大于等于1:20的特免血浆；(2)将筛选出的高效特免血浆混合；(3)将上述混合血浆采用低温乙醇压滤法分离并结合离子交换层析法分离纯化免疫球蛋白组分Ⅱ，经过滤、层析、超滤、配制、低pH孵放灭活病毒、纳米膜过滤去除病毒，分装得到纯度98.5％‑100％的免疫球蛋白，抗体效价不低于1：500。该制备和生产方法得到的巨细胞人免疫球蛋白抗体效价、纯度和回收率高，可以针对性的对巨细胞病毒进行治疗，是治疗巨细胞病毒在人群中引起的隐性和显性感染的有效药物，安全可靠，具有较大的社会效益和经济效益。

An Intravenous Giant Cell Human Immunoglobulin and Its Preparation Method

The invention relates to an intravenous human immunoglobulin with cytomegalovirus neutralizing antibody titer greater than or equal to 1:500 and a preparation method thereof. The preparation method includes: (1) screening specific immune plasma with neutralizing antibody titer greater than or equal to 1:20; (2) mixing highly effective specific immune plasma; (3) separating and purifying immunoglobulin component II by cryogenic ethanol pressure filtration and ion exchange chromatography, and then filtering, chromatography, ultrafiltration, formulation, low pH incubation inactivation of virus and nanomembrane. The purity of immunoglobulin was 98.5%100% and the titer of antibody was no less than 1:500. The titer, purity and recovery of human immunoglobulin antibody obtained by this preparation and production method are high. It can be targeted for the treatment of cytomegalovirus. It is an effective drug for the treatment of recessive and dominant infections caused by cytomegalovirus in the population. It is safe and reliable, and has great social and economic benefits.

【技术实现步骤摘要】
一种静注巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法
本专利技术涉及生物制药领域的治疗用血液制品，特别是涉及一种巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法。
技术介绍
人巨细胞病毒(Humancylomegalovirus，HCMV)，也称人疱疹病毒5型(HHV5)，属β疱疹病毒亚科。HCMV是人类先天性病毒感染的最常见病原之一，该病毒在我国成人感染率高达95％以上。普通人通常为隐性感染，但对于免疫力低下人群，如骨髓和实体器官移植受者、HIV感染者和肿瘤患者，HCMV感染会导致严重后果。孕妇原发或复发HCMV感染引起新生儿宫内感染或围产期感染侵袭胎儿，可致感染患儿中枢神经系统受累、多器官损害、智力低下或耳聋等；在正常健康人中可引起单核细胞增多症；在免疫缺陷者如器官移植受者、获得性免疫缺陷综合症者及癌症患者中可引起严重的感染，甚至死亡。国外临床上广泛使用抗病毒药物联合巨细胞病毒特异性人免疫球蛋白(CMV-IVIG)防治实体器官移植患者术后HCMV感染及相关疾病。但目前国内尚无CMV-IVIG上市，因此，开发高效价的HCMV特异性中和抗体的人免疫球蛋白制品具有重要意义。但是由于巨细胞人免疫球蛋白对于原料选择以及制备条件的要求比较苛刻，所以目前的巨细胞人免疫球蛋白普遍存在效率低、性质不稳定等问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种有效治疗巨细胞病毒重症感染的人免疫球蛋白及其制备方法，使其应用于工业化生产，且产品高效、安全、可靠。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：本专利技术提供一种静注巨细胞人免疫球蛋白，巨细胞人免疫球蛋白中和抗体效价大于等于1∶500。所述免疫球蛋白与正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀线为IgG。免疫球蛋白纯度与总蛋白的质量百分比在98.5％-100％之间。在制备时，其原料血浆为巨细胞病毒抗体效价不低于1∶20的血浆。所述免疫球蛋白的单体和二聚体之和达到99％-99.5％，PKA(中文含义为激肽释放酶原激活剂)≤30IU/mL，ACA(中文含义为抗补体活性)≤45％。本专利技术所述静注巨细胞人免疫球蛋白可以有效治疗巨细胞病毒重症感染，具有高效、安全和可靠等优点，适合大规模的工业化生产。为方便使用以及长久的保持其有效，本专利技术所述静注巨细胞人免疫球蛋白的剂型为液体制剂或冻干制剂。本专利技术提供一种静注巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)用中和试验法筛选出巨细胞病毒不低于1∶20中和抗体效价滴度的原料血浆；(2)以筛选后的所述血浆原料制备混合血浆供试品，所述混合血浆中巨细胞病毒中和抗体效价滴度不低于1∶160；(3)将所述混合血浆供试品采用低温乙醇压滤法分离结合阴离子交换层析法纯化生产人免疫球蛋白，生产操作压力为0.05-0.3MPa，包括从血浆中分离组分II+III沉淀、从组分II+III中分离组分II、层析、超滤、病毒灭活、配置、分装得到产品。进一步，步骤(1)所述中和试验法具体步骤包括：(A)样品稀释：血浆样本用细胞维持液预先进行1∶4预稀释后，56℃灭活30分钟，之后继续5倍稀释，即最终1∶20倍稀释样品液；打开足够量的96孔细胞板，标明病毒回滴用板和样品试验板，并在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒性型号和代次；将预先灭活的1∶20倍稀释样品液分别加入到96孔细胞板的相应位置，每孔加样品50μL，病毒回滴孔与阴性对照孔分别加50μL细胞维持液，每样品作竖向两孔平行；所述细胞维持液为体积比为5％的胎牛血清的MEM液；(B)攻击病毒：攻击病毒液制备：根据试验的标本数用细胞维持液制备足量的攻击病毒液，将病毒稀释到100CCID50/0.05mL；除病毒回滴孔与阴性对照孔外，其余各孔中均加入50μL含100CCID50的攻击病毒液；回滴100CCID50攻击病毒液：用细胞维持液将攻击病毒液作10-1、10-2、10-3稀释，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，每个稀释度加10孔，50μL/孔；阴性对照：向阴性对照各孔中再加入50μL细胞维持液；将所有96孔细胞板放入37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中和培养2小时；(C)细胞悬液的配制与添加：细胞悬液的配制：取足够量的MRC-5细胞，消化后计数，稀释至试验所需的细胞液量，试验用细胞悬液浓度应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用；细胞悬加：将步骤(B)中和培养后的每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；(D)培养及观察统计：将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养11天，病毒接种后的第9天显微镜下观察细胞生长情况，第11天最终判定结果，并记录统计。进一步，步骤(3)生产人免疫球蛋白的具体步骤包括：(A)从血浆中分离组分II+III：将冷冻血浆在温度2-4℃之间融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到7.0-7.2，加入体积分数为54％的乙醇溶液，使血浆中乙醇的最终浓度为8％-10％，使反应液的最终温度为-2至-4℃，离心分离组分I，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到5.9-6.0，加入体积分数为95％的乙醇溶液，使血浆中乙醇的浓度达到20％，使反应液的最终温度控制在-2.0℃至-5.0℃，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀；(B)将上步加压过滤后的组分II+III沉淀加入4-8倍质量预冷的注射用水溶解，使反应温度控制在0至4.0℃。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.05-5.25，加入体积分数为95％的乙醇溶液，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-3.5℃至-6.5℃，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液；向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.1-7.5，按每升溶液添加2.8g氯化钠的比例补加氯化钠以提高反应液离子强度；加入体积分数为95％的乙醇溶液，使反应液中乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-9.0℃至-12.0℃，继续搅拌0.5小时，静止1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为巨细胞人免疫球蛋白的粗制品；(C)加入6-8倍质量的组分II沉淀量的注射用水溶解后，澄清过滤、超滤脱盐，控制蛋白液电导率不高于0.35ms/cm，按每升蛋白液加入80-120g甘氨酸的比例加入甘氨酸作为保护剂，用0.1-0.5mol/L碳酸氢钠溶液调整蛋白液pH至7±0.2，在60.0±0.5℃条件下巴氏灭活10小时；(D)巴氏灭活结束后，降温制品至25℃以下，用0.1mol/L盐酸溶液调整制品pH为6.8-7.2，降温蛋白液至2℃以下，搅拌加入-15℃以下的体积分数为95％的乙醇溶液，使制品中乙醇浓度为18％-22％，控制最终温度在-1至6℃，搅拌反应1小时以上，按0.5-2g/L蛋白液加入助滤剂硅藻土，继续反应1小时后压滤分离沉淀，滤过液温度控制在6℃以下，压力控制在0-0.3Mpa，沉淀废弃，之后，用0.1mol/L氢氧化钠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种静注巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用中和试验法筛选出巨细胞病毒不低于1∶20中和抗体效价滴度的原料血浆；(2)以筛选后的所述血浆原料制备混合血浆供试品，所述混合血浆中巨细胞病毒中和抗体效价滴度不低于1∶160；(3)将所述混合血浆供试品采用低温乙醇压滤法分离结合阴离子交换层析法纯化生产人免疫球蛋白，生产操作压力为0.05‑0.3MPa，包括从血浆中分离组分II+III沉淀、从组分II+III中分离组分II、层析、超滤、病毒灭活、配制、分装得到产品；步骤(3)生产人免疫球蛋白的具体步骤包括：(A)从血浆中分离组分II+III：将冷冻血浆在温度2‑4℃之间融化，离心去冷沉淀，调节血浆pH值到7.0‑7.2，加入乙醇使血浆中乙醇的最终浓度为8％‑10％，使反应液的最终温度为‑2至‑4℃，离心分离组分I，调节组分I上清液的pH到5.9‑6.0，加入乙醇溶液使血浆中乙醇的浓度达到20％，使反应液的最终温度控制在‑2.0℃至‑5.0℃，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀；(B)将上步加压过滤后的组分II+III沉淀加入4‑8倍质量预冷的注射用水溶解，使反应温度控制在0‑4.0℃，调节制品的pH值为5.05‑5.25，加入体积分数为95％的乙醇溶液，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在‑3.5℃至‑6.5℃，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液；将组分III上清液调节pH值为7.1‑7.5，按每升溶液添加2.8g氯化钠的比例补加氯化钠以提高反应液离子强度；加入乙醇溶液使反应液中乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为‑9.0℃至‑12.0℃，继续搅拌0.5小时，静止1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为巨细胞人免疫球蛋白的粗制品；(C)加入6‑8倍质量组分II沉淀量的注射用水溶解后，澄清过滤、超滤脱盐控 制蛋白液电导率不高于0.35ms/cm，按每升蛋白液加入80‑120g甘氨酸的比例加入甘氨酸作为保护剂，调整蛋白液pH至7±0.2，在60.0±0.5℃条件下巴氏灭活10小时；(D)巴氏灭活结束后，降温制品至25℃以下，调整制品pH为6.8‑7.2，降温蛋白液至2℃以下，搅拌条件下加入‑15℃以下的乙醇溶液使制品中乙醇浓度为18％‑22％，控制最终温度在‑1至6℃，搅拌反应1小时以上，按0.5‑2g/L蛋白液加入助滤剂硅藻土，继续反应1小时后压滤分离沉淀，滤过液温度控制在6℃以下，压力控制在0‑0.3Mpa，沉淀废弃，之后调整滤出液pH为6.9‑7.3，搅拌加入‑15℃以下的体积分数为95％乙醇的乙醇溶液，使制品中乙醇终浓度为20％‑24％，控制最终温度在‑6至‑12℃，搅拌反应1小时以上，压滤分离沉淀，滤过液温度控制在‑3℃以下，压力控制在0‑0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取沉淀称重；(E)将步骤(D)加压后的沉淀用0‑4℃注射用水溶解6‑8小时，溶解温度控制在0℃‑3.0℃；将充分溶解的组分II过滤澄清，调节溶液的pH值至6.40‑6.80之间，调节溶液的电导率为1.30‑1.50ms/m；采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱；用AKTA‑process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.40‑6.80的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.40‑6.80后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.40‑6.80的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白合并滤过液和后顶液称重调节溶液pH至3.60‑3.90，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中；(F)启动超滤器，开始初浓缩，控制温度在3℃‑9.0℃之间，蛋白浓度达到6％‑8％时，蛋白浓度单位为g/mL，加入3.0℃‑9.0℃注射用水，使液蛋白浓度在2％‑6％并进行恒体积超滤透析脱盐，超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定；透析过程中保持蛋白液pH在3.50‑4.00；透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用3.0℃‑9.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中；(G)向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，调整浓缩后蛋白液的pH值为3.80‑4.40，使最终制品中免疫球蛋白含量为50‑56g/L，麦芽糖含量为9％‑11％，其单位为g/mL，抗体效价不低于1∶500，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法使制品保持在21℃‑25℃下21天进行病毒灭活；(H)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量...

【技术特征摘要】
1.一种静注巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用中和试验法筛选出巨细胞病毒不低于1∶20中和抗体效价滴度的原料血浆；(2)以筛选后的所述血浆原料制备混合血浆供试品，所述混合血浆中巨细胞病毒中和抗体效价滴度不低于1∶160；(3)将所述混合血浆供试品采用低温乙醇压滤法分离结合阴离子交换层析法纯化生产人免疫球蛋白，生产操作压力为0.05-0.3MPa，包括从血浆中分离组分II+III沉淀、从组分II+III中分离组分II、层析、超滤、病毒灭活、配制、分装得到产品；步骤(3)生产人免疫球蛋白的具体步骤包括：(A)从血浆中分离组分II+III：将冷冻血浆在温度2-4℃之间融化，离心去冷沉淀，调节血浆pH值到7.0-7.2，加入乙醇使血浆中乙醇的最终浓度为8％-10％，使反应液的最终温度为-2至-4℃，离心分离组分I，调节组分I上清液的pH到5.9-6.0，加入乙醇溶液使血浆中乙醇的浓度达到20％，使反应液的最终温度控制在-2.0℃至-5.0℃，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀；(B)将上步加压过滤后的组分II+III沉淀加入4-8倍质量预冷的注射用水溶解，使反应温度控制在0-4.0℃，调节制品的pH值为5.05-5.25，加入体积分数为95％的乙醇溶液，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-3.5℃至-6.5℃，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液；将组分III上清液调节pH值为7.1-7.5，按每升溶液添加2.8g氯化钠的比例补加氯化钠以提高反应液离子强度；加入乙醇溶液使反应液中乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-9.0℃至-12.0℃，继续搅拌0.5小时，静止1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为巨细胞人免疫球蛋白的粗制品；(C)加入6-8倍质量组分II沉淀量的注射用水溶解后，澄清过滤、超滤脱盐控制蛋白液电导率不高于0.35ms/cm，按每升蛋白液加入80-120g甘氨酸的比例加入甘氨酸作为保护剂，调整蛋白液pH至7±0.2，在60.0±0.5℃条件下巴氏灭活10小时；(D)巴氏灭活结束后，降温制品至25℃以下，调整制品pH为6.8-7.2，降温蛋白液至2℃以下，搅拌条件下加入-15℃以下的乙醇溶液使制品中乙醇浓度为18％-22％，控制最终温度在-1至6℃，搅拌反应1小时以上，按0.5-2g/L蛋白液加入助滤剂硅藻土，继续反应1小时后压滤分离沉淀，滤过液温度控制在6℃以下，压力控制在0-0.3Mpa，沉淀废弃，之后调整滤出液pH为6.9-7.3，搅拌加入-15℃以下的体积分数为95％乙醇的乙醇溶液，使制品中乙醇终浓度为20％-24％，控制最终温度在-6至-12℃，搅拌反应1小时以上，压滤分离沉淀，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0-0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取沉淀称重；(E)将步骤(D)加压后的沉淀用0-4℃注射用水溶解6-8小时，溶解温度控制在0℃-3.0℃；将充分溶解的组分II过滤澄清，调节溶液的pH值至6.40-6.80之间，调节溶液的电导率为1.30-1.50ms/m；采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱；用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.40-6.80的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.40-6.80后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.40-6.80的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白合并滤过液和后顶液称重调节溶液pH至3.60-3.90，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中；(F)启动超滤器，开始初浓缩，控制温度在3℃-9.0℃之间，蛋白浓度达到6％-8％时，蛋白浓度单位为g/...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨莉，于引航，孙晓东，闫磊，孙婷，
申请(专利权)人：哈尔滨派斯菲科生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23