本发明专利技术公开了一种抗犬细小病毒抗体的重链、轻链可变区及基因工程抗体，属于抗体工程技术领域。本发明专利技术提供的抗犬细小病毒抗体的重链、轻链的可变区氨基酸序列和核苷酸序列，为构建高亲和力、低免疫原性的抗犬细小病毒的基因工程抗体提供支持。本发明专利技术还将犬细小病毒的单克隆抗体的可变区序列与鼠源恒定区进行组装，得到抗犬细小病毒的基因工程抗体，表现出良好的中和CPV病毒的活性，且具有抑制犬细小病毒对红细胞的凝集作用，可将其应用于犬细小病毒单克隆抗体犬源化研究等领域，对推动犬源化单克隆抗体药物的发展具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种抗犬细小病毒抗体的重链、轻链可变区及基因工程抗体
本专利技术涉及抗体工程
，尤其涉及一种抗犬细小病毒抗体的重链、轻链可变区，包括其氨基酸序列和核苷酸序列，以及利用其构建的抗犬细小病毒的基因工程抗体。
技术介绍
犬细小病毒(Canineparvo-virus，CPV)是细小病毒科细小病毒属的成员，主要感染幼犬，能引起幼犬剧烈呕吐、白细胞显著减少，临床症状以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征，幼犬发病急，传染快，死亡率高，严重危害养犬业的发展，给养犬业造成了严重的经济损失。预防犬细小病毒病的疫苗主要有：灭活苗、弱毒苗、多联苗，但是市场上仅20％的疫苗能产生100％保护力的抗体。对于犬细小病毒感染，目前尚没有特效药物，临床上多采用对症治疗、支持疗法和特异性疗法联合应用。其中，特异性疗法，一般早期采用犬细小病毒单克隆抗体及犬细小病毒抗血清，进行抑制病毒对宿主细胞的侵染及病毒的复制，提高免疫力。由于单克隆抗体的应用已经由体外诊断转向体内定位或者体内抗体治疗，特别是在临床治疗病毒疾病、自身免疫疾病具有较强的优势。而鼠源单克隆抗体对非鼠源体有较强的异源性和免疫原性，在体内应用时容易引起宿主的免疫排斥或过敏反应，使得鼠源单克隆抗体疗效降低，甚至在病体内产生严重后果,极大地限制了鼠源单克隆抗体的临床应用的效果，因此对鼠源单克隆抗体进行改造成为必要，经过改造的鼠源单抗降低了其免疫原性，可以更加有效应用于临床和治疗各种疾病。目前，市场上的犬细小病毒单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，单克隆抗体和抗血清的免疫原性强，在治疗过程中会存在副作用降低疗效，极大地限制了其临床犬细小病犬的应用。因此，制备低免疫原性、高亲和力、特异性强的单克隆抗体更有利于推动抗体药物的大规模临床应用。采用的基因工程法获得表达靶抗体的基因序列，对于降低免疫原性的进一步改造至关重要。目前犬细小病毒单克隆抗体犬源化研究较少，本专利技术提取了以犬细小病毒的单克隆抗体的可变区序列，并将其与鼠源恒定区进行组装，得到抗犬细小病毒的基因工程抗体，表现出良好的中和CPV病毒的活性，可应用于犬细小病毒单克隆抗体犬源化研究等领域，对推动犬源化单克隆抗体药物的发展具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗犬细小病毒抗体的可变区编码序列和抗犬细小病毒的基因工程抗体，能够特异性的识别犬细小病毒，对犬细小病毒有很高的亲和力，降低免疫原性。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供了一种针对犬细小病毒鼠源的基因工程抗体。本专利技术还提供了优选的抗犬细小病毒抗体的重链可变区氨基酸序列和核苷酸序列。本专利技术还提供了优选的抗犬细小病毒抗体的轻链可变区氨基酸序列和核苷酸序列。本专利技术所述的抗犬细小病毒鼠的基因工程抗体可以是，例如，单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物或同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的抗犬细小病毒抗体的重链、轻链的可变区氨基酸序列和核苷酸序列，为构建高亲和力、低免疫原性的抗犬细小病毒的基因工程抗体提供支持。本专利技术还将犬细小病毒的单克隆抗体的可变区序列与鼠源恒定区进行组装，得到抗犬细小病毒的基因工程抗体，表现出良好的中和CPV病毒的活性，且具有抑制犬细小病毒对红细胞的凝集作用，可将其应用于犬细小病毒单克隆抗体犬源化研究等领域，对推动犬源化单克隆抗体药物的发展具有重要意义。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1提供的抗犬细小病毒抗体的重链和轻链的类型鉴定图；图2为本专利技术实施例2提供的抗犬细小病毒抗体的重链和轻链的可变区PCR产物电泳图；图3为本专利技术实施例2提供的抗犬细小病毒抗体的重链和轻链的质粒构建酶切鉴定图。图4为本专利技术实施例3提供的抗犬细小病毒的基因工程抗体与犬细小病毒的阻抗作用图谱；图5为本专利技术实施例3提供的抗犬细小病毒的基因工程抗体与犬细小病毒的中和作用图谱。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面将结合实施例对本专利技术作进一步的详细介绍。需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。本专利技术中采用的犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、犬瘟病毒均来源于军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所。实施例1小鼠CPV单克隆抗体的制备和筛选(1)杂交瘤细胞系制备动物的免疫选取5只6～8周龄雌性BALB/c小鼠，向小鼠注射浓缩纯化的犬细小病毒第三代病毒和等量弗氏完全佐剂乳化物，每只皮下多点注射200μl。两周后进行二免，向小鼠注射犬细小病毒浓缩纯化病毒和等量弗氏不完全佐剂乳化物，注射量和方法同首次免疫。二次免疫两周后按照第二次免疫进行第三次免疫，三免两周后选取经剪尾采血后，采用间接ELISA法测定血清效价高的小鼠进行腹腔注射。细胞融合将8周龄左右的BALB/c小鼠断颈处死后，75％酒精浸泡10分钟。将处死的小鼠腹腔获得饲养细胞，加入到96孔细胞培养板100μl/孔，放入细胞培养箱中培养24小时。筛选过的SP2/0细胞在融合前48小时传代扩大培养，使其处于生长对数期。选取效价高的BALB/c免疫小鼠制备单个脾细胞悬液。对悬液进行细胞计数。将免疫脾细胞与SP2/0以6︰1的比例混合于无菌离心管中，吸取经37℃预热的50％PEG4000进行细胞融合。离心后加入含有HAT12％FBS的RPMI-1640完全培养液，悬浮融合的细胞沉淀。取出提前铺有饲养细胞的96孔板，加入融合细胞悬液100μl/孔，并做好标记于细胞培养箱培养，每天观察细胞变化。阳性融合孔的筛选细胞融合5天后，用含HAT，20％FBS的RPMI-1640培养液换掉一半原培养液。融合12天后将HAT换为HT培养液。融合17天后换为正常细胞培养液。在整个培养筛选的过程中，密切观察每孔细胞的生长变化，当有细胞融合簇出现且融合细胞达足够数量时，对融合孔采用间接ELISA法连续三次以上检测阳性的孔做好标记，及时克隆化。对连续克隆化两次以上且一直是阳性结果的孔内细胞进行扩大培养和冻存。随时检测细胞分泌抗体的情况。对扩大培养的检测一直阳性结果的单克隆细胞株按照常规方法进行冻存，冻存细胞液按照RPMI-1640︰FBS︰DMSO＝7︰2︰1比例配制。标记好冻存细胞株代号，冻存日期。(2)单克隆抗体免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定取杂交瘤细胞株培养上清，采用IsoStripMouseMonoclonalAntibodyIsotyping试剂盒(Roche公司)测定抗体重链、轻链类型。经鉴定，鼠源CPV基因工程抗体亚型为IgGa2b/kappa。(3)非竞争性ELISA测定CPV单克隆抗体的相对亲和力包被抗原为纯化CPV-VLPs，按1、0.5、0.25、0.125μg/ml包被酶标板，每孔100μl，4℃包被过夜；加入配制好的BSA，每孔150μl，37℃封闭2h；PBST洗涤后，按确定的单抗浓度，将单抗从80ng/ml开始进行倍比稀释，以抗体浓度的对数值为横坐标，以其对本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗犬细小病毒抗体的重链、轻链可变区，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种抗犬细小病毒抗体的重链、轻链可变区，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种DNA分子，编码如权利要求1所述的抗犬细小病毒的基因工程抗体的重链、轻链可变区。3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，编码抗犬细小病毒抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，编码抗犬细小病毒的轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。4.一种抗犬细小病毒的基因工程抗体，...
【专利技术属性】
技术研发人员：石晶，李雪，殷玉和，李希辰，赵健，刘伟，付玉，张馨月，
申请(专利权)人：长春西诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22
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