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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物免疫球蛋白制品的生物学活性检测,尤其涉及一种猫igg的fc段生物学活性测定方法。
技术介绍
1、免疫球蛋白具有抗体活性的动物蛋白,主要存在于血浆中,也见于其他体液、组织和一些分泌液中。免疫球蛋白是机体受抗原(如病原微生物)刺激后产生的,其主要作用是与抗原产生免疫反应,生成抗原-抗体复合物,从而阻断病原体对机体的危害,使病原微生物失去致病作用。
2、人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白中,可分为五类,即免疫球蛋白g(igg)、免疫球蛋白a(iga)、免疫球蛋白m(igm)、免疫球蛋白d(igd)和免疫球蛋白e(ige),其中igg是最主要的免疫球蛋白。igg分子由4条肽链组成,包含轻链和重链,轻链与重链之间通过二硫键相连接。
3、igg是典型的“y”字结构,包含fab段和fc段,fab段的可变区与相应抗原决定簇的立体构型吻合,才能结合。抗体fab段与相应抗原结合后,igg的fc段变构,其重链恒定区上的补体结合点暴露,c1q遂与之结合,从而使补体各成分激活,产生其他生物学活性,此称为补体激活的经典途径。
4、静脉丙种球蛋白(intravenous immunoglobulin,ivig)是指来自富含igg制剂的血制品,最初用于低igg的替代治疗。1982年who要求ivig制剂中fc相关功能(激活补体和结合fc受体的功能)不受影响。所以,国外很早就已经建立了ivig制剂fc段相关功能的检测方法。《欧洲药典》均收载有人igg的fc段生物学活性测定方法,其方法中用的红细胞为人“
5、目前,有关人ivig制剂中fc段生物学活性测定方法已在人类医学中得到验证,人igg的fc段生物学活性测定的原理为:依据特异性抗体(免疫球蛋白)fab段与红细胞上包被的相应抗原结合,抗体暴露出fc段补体c1q的结合位点,从而激活后续的补体各成分,最终导致红细胞的细胞膜受到攻击、破裂,释放出血红蛋白。再通过溶血反应动力学曲线,计算免疫球蛋白激活补体活性的功能指数。然而,关于动物igg的fc段生物学活性未有研究报道。由于种属特性等各种原因,《中国药典》和《欧洲药典》收载的人免疫球蛋白igg fc段生物学活性测方法并不能适用于动物来源的制品检测。
6、本研究的供试品为静注猫免疫球蛋白(ph4),其主要成分为猫igg。为建立猫igg的fc段生物学活性的测定方法,首先对猫红细胞、绵羊红细胞进行筛选,抗原的选择应该考虑供试品中针对此种抗原的特异性抗体滴度水平,根据猫的免疫程序,选择猫细小病毒(feline parvovirus,fpv)、猫杯状病毒(feline calicivirus,fcv)、猫疱疹病毒(felineherpesvirus,fhv)以及fcov是猫冠状病毒(feline coronavirus)四种抗原进行试验,抗原确定后,对供试品中针对此种抗原的特异性抗体确定。因此,通过对上述关键因素的筛选开发出一种适合猫igg的fc段生物学活性的测定方法。此外,药典中使用的巴比妥钠属于dea管制类化学品(禁售),因此也需要仔细斟酌研究进而选用其它的化学试剂进行代替,以保证试验能顺利开展。
技术实现思路
1、本专利技术目的是提出一种猫igg的fc段生物学活性测定方法。
2、为了实现上述目的,本专利技术的技术方案如下:
3、本专利技术提出的猫igg的fc段生物学活性测定方法,以绵羊红细胞为致敏红细胞,以猫冠状病毒为致敏红细胞抗原,将鞣化后红细胞与氯化铬连接,用猫冠状病毒致敏红细胞,通过抗原抗体的特异性反应,暴露出猫igg的fc段补体c1q的结合位点,加入补体后激活补体反应,导致红细胞膜的破裂,引起溶血;再通过溶血反应动力学曲线,计算猫igg的fc段激活补体功能指数,猫igg的fc段激活补体功能指数≥70%。
4、进一步地,供试品中抗猫冠状病毒中和抗体效价抗体为1:64以上。
5、进一步地,用牛血清白蛋白-tris(at)缓冲液进行致敏后红细胞的处理。
6、进一步地,猫冠状病毒的病毒含量应不低于108.00tcid50/ml。
7、进一步地,猫igg的fc段生物学活性测定方法,包括以下步骤:
8、s1、红细胞的处理:
9、静脉采集健康动物的血液至装有阿氏液的无菌管中,用pbs洗涤后离心分离红细胞,用pbs制备成2%的细胞悬液;
10、s2、红细胞的鞣化:
11、取鞣酸溶液与等体积的2%红细胞悬液混匀,放于37℃水浴中鞣化30分钟,用pbs洗涤后用pbs制备成1%的红细胞悬液;
12、s3、红细胞的致敏反应:
13、取猫冠状病毒与0.5%氯化铬溶液按照体积比1:0.125混匀后,置37℃水浴中静置反应15分钟,得到联结铬的抗原;
14、取1%的红细胞悬液,加入联结铬的抗原混匀,置37℃水浴反应30分钟,每隔10分钟混匀一次;离心去上清,用pbs洗涤沉淀,用at缓冲液悬浮红细胞,取红细胞悬液用at缓冲液调节浓度,使其在541nm处的吸光度值为1.0±0.1,即为致敏红细胞悬液;
15、s4、供试品溶液的制备:
16、用饱和碳酸氢钠溶液将供试品ph值调至6.8~7.0,供试品中抗猫冠状病毒中和抗体效价抗体为1:64以上;再用at缓冲液将供试品igg浓度稀释至每1ml含20mg;
17、s5、抗原抗体反应:
18、取供试品溶液7ml,加致敏红细胞悬液1ml混匀,置37℃水浴反应30分钟,每隔10分钟混匀一次;离心去上清,用at缓冲液洗涤沉淀;向红细胞沉淀中加入0.7ml at缓冲液重悬红细胞,混匀后置37℃水浴中反应6分钟,每10s混一次;
19、s6、测定法:
20、抗原抗体反应完成后,取200μl红细胞悬液放入酶标板中,加入已稀释至每1ml含100ch50的补体100μl,混匀10秒,立即放入酶标仪中在541nm处测定起始吸光度值as,之后每隔1分钟测定1次,即得供试品在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线;当吸光度值越过了曲线的内曲点后即停止测量;取7ml at缓冲液作为阴性对照,替换步骤s5中供试品溶液并重复步骤s5和s6,测定吸光度值;
21、s7、供试品激活补体功能指数确定:
22、以测定时间为横坐标,以吸光度值为纵坐标绘制溶血反应动力学曲线图,当吸光度值越过了曲线的内曲点后即可停止测量,计算供试品激活补体功能指数,通过供试品的激活补体功能指数确定猫igg的fc段生物学活性。
23、进一步地,步骤s1中,pbs的ph为7.2,配制方法为:称取无水磷酸氢二钠1.02g、无水磷酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猫IgG的Fc段生物学活性测定方法,其特征在于,以绵羊红细胞为致敏红细胞,以猫冠状病毒为致敏红细胞抗原,将鞣化后红细胞与氯化铬连接,用猫冠状病毒致敏红细胞,通过抗原抗体的特异性反应,暴露出猫IgG的Fc段补体C1q的结合位点,加入补体后激活补体反应,导致红细胞膜的破裂,引起溶血;再通过溶血反应动力学曲线,计算猫IgG的Fc段激活补体功能指数,猫IgG的Fc段激活补体功能指数≥60%。
2.根据权利要求1所述的猫IgG的Fc段生物学活性测定方法,其特征在于,供试品要求抗猫冠状病毒中和抗体效价为1:64以上。
3.根据权利要求1所述的猫IgG的Fc段生物学活性测定方法,其特征在于,用牛血清白蛋白-Tris缓冲液进行抗原抗体反应后红细胞的处理。
4.根据权利要求4所述的猫IgG的Fc段生物学活性测定方法,其特征在于,猫冠状病毒的病毒含量应不低于108.00TCID50/ml。
5.根据权利要求1所述的猫IgG的Fc段生物学活性测定方法,其特征在于,包括以下步骤:
6.根据权利要求5所述的猫IgG的Fc段生物学活性测定方
7.根据权利要求6所述的猫IgG的Fc段生物学活性测定方法,其特征在于,步骤S2中,鞣酸溶液的配制方法为:称取鞣酸1mg,加pH7.2 PBS 10ml,使溶解混匀,即得A液,量取A液0.1ml,加pH7.2的PBS7.5ml,混匀,即得0.0013mg/ml鞣酸溶液。
...【技术特征摘要】
1.一种猫igg的fc段生物学活性测定方法,其特征在于,以绵羊红细胞为致敏红细胞,以猫冠状病毒为致敏红细胞抗原,将鞣化后红细胞与氯化铬连接,用猫冠状病毒致敏红细胞,通过抗原抗体的特异性反应,暴露出猫igg的fc段补体c1q的结合位点,加入补体后激活补体反应,导致红细胞膜的破裂,引起溶血;再通过溶血反应动力学曲线,计算猫igg的fc段激活补体功能指数,猫igg的fc段激活补体功能指数≥60%。
2.根据权利要求1所述的猫igg的fc段生物学活性测定方法,其特征在于,供试品要求抗猫冠状病毒中和抗体效价为1:64以上。
3.根据权利要求1所述的猫igg的fc段生物学活性测定方法,其特征在于,用牛血清白蛋白-tris缓冲液进行抗原抗体反应后红细胞的处理。
4.根据权利要求4所述的猫igg的fc段生物学活性测定方法,其...
【专利技术属性】
技术研发人员:夏振强,倪婷婷,崔玉梅,叶明,蒋凡,姜旭,汪玉彬,卢继龙,张馨月,祖宁,栾福英,刘伟,石晶,
申请(专利权)人:长春西诺生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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