定量重链和轻链多肽对的方法技术

本发明专利技术提供当重链和两条独特轻链共表达时定量确定个别IgG重链与特定IgG轻链选择性配对的能力的方法。所述方法以合理通量来提供结果并且是稳健和准确的。所述共表达的重链和轻链不需要分离和纯化，从而使得能够更有效筛选。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】定量重链和轻链多肽对的方法交叉引用本申请要求2012年10月3日提交的美国临时申请No.61/744,911的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文以用于所有目的。背景此前已描述了识别并量化重链和轻链的共表达产物的方法。例如，液相色谱-质谱法(LC-MS)和离子交换色谱法(IEX)已经用于描述双特异性抗体构建体的纯度(参见例如Strop等(2012)J.Mol.Biol.420:204-219)。基于的活性夹心ELISA也已经用于高通量筛选来选择分泌高产量的具有良好纯度的双特异性抗体的稳定细胞系。(参见例如vanderNeutKolfschonten等(2007),Science317:1554-1557)。也已经描述使用酵母来展示抗体的方法(参见例如Chao等,NatProtoc.2006；1(2):755-68)。使用例如亲和色谱来分离或纯化抗体的方法在本领域中是熟知的并且亲和力纯化柱是可购得的。定量免疫球蛋白重链/轻链免疫测定，(HLC,TheBindingSiteGroup,Birmingham,UK)，是可购得的，并且包括测量IgGκ/IgGλ对的步骤。此测定用于量化患有疾病例如像多发性骨髓瘤的患者的单株免疫球蛋白。专利技术概述双特异性IgG(呈接近于野生型IgG的格式)通常通过两条独特抗体重链和两条独特抗体轻链的细胞内同时表达来形成。正确形成此类型双特异性格式是具有挑战性的，因为抗体重链已经演化成以相对混杂的方式结合至抗体轻链。因此，当两条独特抗体重链和两条独特抗体轻链共表达时，产生多个抗体分子，其中所需双特异性抗体通常少量形成。避免此问题的一种方法是使用选择性配对以形成所需双特异性抗体的抗体重链和抗体轻链。因此，需要允许识别选择性彼此配对的IgG重链和IgG轻链的筛选测定。提供适用于确定是否特定免疫球蛋白(例如，IgG)重链选择性结合至特定免疫球蛋白(例如，IgG)轻链的测定和分析工具。本文提供高通量量化重链多肽与至少一个轻链多肽配对的选择性的方法、测定、系统和试剂盒。还提供确定在竞争重链或轻链多肽或其组合存在下含有Fab的构建体的选择性形成的方法、系统和试剂盒。还提供使用本文所述测定来设计或制造二互补位抗体构建体的方法。还提供确定抗体异源二聚体形成的方法。提供量化与至少一个轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，包括以下步骤：(a)共表达一组构建体：包含VH和CH1区的第一重链多肽；包含第一VL和第一CL区的第一轻链多肽；和包含第二VL和第二CL区的第二轻链多肽；其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；(b)将包含与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的重链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和(c)在重链配对多肽产物中，定量与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的量；其中与另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的选择性。在这类方法的一个实施方案中，第一或第二重链多肽还包括Fc区。在这类方法的另一个实施方案中，第一和第二重链多肽还包括Fc区。在这类方法的另一个实施方案中，第一或第二重链多肽包括Fc区和Fv区。在这类方法的另一个实施方案中，第一和第二重链多肽包括Fc区和Fv区。应了解可进行此过程来将至少一个轻链多肽与至少第一重链多肽和第二重链多肽配对。在所述方法的一个实施方案中，步骤(c)包括量化在捕获HC:LC1:LC2的表面检测到的HC:LC1:LC2之间的配对，其中所述方法包括捕获和检测方法例如像ELISA、SPR芯片、双分子荧光互补读出、荧光活化细胞分选(FACS),荧光偏振/各向异性(FP)、荧光/Foerster共振能量转移(FRET、TR-FRET、HTRF)、或其组合；并且针对一个或多个所述单元与所述环境之间的相互作用来筛选所述表面。本文提供量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，包括以下步骤：(a)共表达一组构建体包含：包含VL和CL区的第一轻链多肽；包含第一VH和第一CH1区的第一重链多肽；和包含第二VH和第二CH1区的第二重链多肽；其中表达所述轻链多肽和所述重链多肽以使得轻链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；(b)将包括与所述第一或第二重链多肽配对的轻链多肽的轻链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和(c)在轻链配对多肽产物中，与所述第一重链多肽配对的轻链多肽的量，和与所述第二重链多肽配对的轻链多肽的量；其中与另一个重链多肽相比，与所述第一或第二重链多肽中的一个重链多肽配对的轻链多肽的较大量指示与所述第一或第二重链多肽配对的轻链多肽的选择性。在这类方法的一个实施方案中，第一或第二重链多肽还包括Fc区。在这类方法的另一个实施方案中，第一和第二重链多肽还包括Fc区。在这类方法的另一个实施方案中，第一或第二重链多肽包括Fc区和Fv区。在这类方法的另一个实施方案中，第一和第二重链多肽包括Fc区和Fv区。本文提供量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，包括以下步骤：(a)共表达一组构建体包含：包含VH、CH1、CH2和CH3区的第一重链多肽；包含第一VL和第一CL区的第一轻链多肽；和包含第二VL和第二CL区的第二轻链多肽；其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；(b)将包含与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的重链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和(c)在重链配对多肽产物中，与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的量；其中与另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的选择性。本文提供量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，包括以下步骤：(a)共表达一组构建体包含：包含VH、CH1、CH2和CH3区的全长重链多肽；包含CH2区和CH3区的重链多肽；包含第一VL和第一CL区的第一轻链多肽；和包含第二VL和第二CL区的第二轻链多肽；其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得全长重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；(b)将包含与包含CH2区和CH3区的重链多肽与所述第一或第二轻链多肽配对的全长重链多肽的重链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和(c)在重链配对多肽产物中，与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的量；其中与另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的选择性。配对可通过量化可检测部分来检测。可检测部分可为例如蛋白质结合位点、配体结合位点或包含另一个可检测部分的标签。检测可检测部分可包括测量荧光、淬灭、放射性或化学发光。在一个实施方案中，包含HC:LC1:LC2的环境是复杂分子混合物、细胞上清液、宿主细胞的细胞质或其组合。具有具体轻链标签的抗体的质量可通过分离重链部分的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，其包括以下步骤：(a)共表达一组构建体，其包括：包含VH和CH1区的第一重链多肽；包含第一VL和第一CL区的第一轻链多肽；和包含第二VL和第二CL区的第二轻链多肽；其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得所述重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；(b)将包含与所述第一或第二轻链多肽配对的所述重链多肽的重链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和(c)在所述重链配对多肽产物中，与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的所述量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的所述量；其中与所述另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的所述重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的所述重链多肽的选择性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.10.03 US 61/744,9111.一种量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，其包括以下步骤：(a)共表达一组构建体，其包括：包含VH和CH1区的第一重链多肽H1；包含第一VL和第一CL区的第一轻链多肽L1；和包含第二VL和第二CL区的第二轻链多肽L2；其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得所述重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；(b)将包含与所述第一或第二轻链多肽配对的所述重链多肽的重链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和(c)在所述重链配对多肽产物中，量化与所述第一轻链多肽配对的重链多肽H1L1的所述量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽H1L2的所述量，以产生竞争测定数据；其中与所述另一个轻链多肽相比，与所述第一和第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的所述重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的所述重链多肽的选择性。2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一重链多肽呈Fab形式。3.如权利要求2所述的方法，其中所述重链多肽和第一和第二轻链多肽以0.25:1:1的预定比率表达。4.如权利要求2所述的方法，其中所述重链多肽和第一和第二轻链多肽以1:2:2的预定比率表达。5.如权利要求2所述的方法，其中所述重链多肽和第一和第二轻链多肽以1:3:3的预定比率表达。6.如权利要求2所述的方法，其中所述重链多肽和所述第一和第二轻链多肽以1:1:1的预定比率表达。7.如权利要求2所述的方法，其中所述共表达是在宿主细胞中。8.如权利要求2所述的方法，其中所述共表达是在体外非细胞表达系统中。9.如权利要求2所述的方法，其还包括在表达之后将表达的多肽与所述表达培养基分离的步骤。10.如权利要求9所述的方法，其中所述表达的多肽通过离心来分离。11.如权利要求9所述的方法，其中所述表达的多肽通过使用纯化柱来分离。12.如权利要求1所述的方法，其中包括VH和CH1区的所述第一重链多肽还包括CH3区、或CH2区与CH3区。13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述一组构建体还包括第二重链多肽，所述第二重链多肽包括VH区和CH1区，其中所述第二重链多肽与所述第一重链多肽不同。14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其还包含以下步骤：在不存在其它轻链多肽的情况下，在至少一个宿主细胞中表达所述重链多肽和所述第一和第二轻链多肽中的一个轻链多肽；分离包含所述重链多肽和所述第一和第二轻链多肽中的一个的重链配对多肽产物；和定量所述重链配对多肽产物的量，其中所述量充当所述重链多肽与所述第一和第二轻链多肽中的一个的最大可检测结合的对照标准。15.如权利要求14所述的方法，其中包含所述重链多肽和所需轻链多肽的产物提供所述阳性对照标准。16.如权利要求14所述的方法，其中包含所述重链多肽和不太需要轻链多肽的产物提供所述阴性对照标准。17.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其还包括将任何未结合多肽从所述分离构建体中移除的步骤。18.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中至少一个轻链多肽包括可检测部分。19.如权利要求18所述的方法，其中所述可检测部分是蛋白质结合位点、配体结合位点或包含另一个可检测部分的标签。20.如权利要求19所述的方法，其中所述第一和第二轻链多肽分别用包含不同可检测部分的不同标签来标记。21.如权利要求19所述的方法，其中至少一个轻链多肽包含标签，所述标签能够捕获至包含相互作用表面层的表面上，并且通过设备来进一步检测并量化。22.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述重链多肽用标签来标记。23.如权利要求22所述的方法，其中标记所述重链多肽的所述标签能够捕获至包含相互作用表面层的表面上，并且通过设备来进一步检测并量化。24.如权利要求23所述的方法，其中所述第一和第二轻链多肽分别用包含不同可检测部分的不同标签来标记，并且所述设备能够检测并量化所述第一和第二轻链多肽中的至少一个轻链多肽上的可检测部分。25.如权利要求24所述的方法，其中所述设备能够具有高通量。26.如权利要求18所述的方法，其中所述可检测部分通过ELISA、SPR、双分子荧光互补读出、荧光活化细胞分选、荧光偏振/各向异性、荧光/Foerster共振能量转移、时间分辨荧光能量转移、均相时间分辨荧光、或其组合来检测。27.如权利要求18所述的方法，其中所述可检测部分通过测量荧光、淬灭、放射性或化学发光来检测。28.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述共表达步骤是在作为细菌细胞的宿主细胞中。29.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述共表达步骤是在作为酵母细胞的宿主细胞中。30.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述共表达步骤是在作为哺乳动物细胞的宿主细胞中。31.如权利要求30所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是COS、CHO、BHK、HEK-293、NS0、3T3细胞及其衍生物中的至少一个。32.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述重链和轻链多肽的至少一个包含选自6xHis、FLAG、HA、c-myc、s-FLAG、SBP、V5和ABD的标签。33.如权利要求2所述的方法，其中(c)包括量化在捕获重链配对多肽产物的表面检测到的H1、L1和L2之间的配对，其中所述方法包括ELISA、SPR、双分子荧光互补、荧光活化细胞分选、荧光偏振/各向异性、荧光/Foerster共振能量转移、时间分辨荧光能量转移、均相时间分辨荧光、或其组合。34.如权利要求33所述的方法，其中所述表面从环境捕获所述重链配对多肽产物，所述环境是复杂分子混合物、细胞上清液、宿主细胞的细胞质或其组合。35.如权利要求33所述的方法，其中所述竞争测定数据被传输至通用计算机并且其中所述数据的输出包括将所述结果存储在数据载体上。36.如权利要求35所述的方法，其任选地包括分析所述竞争测定数据。37.如权利要求36所述的方法，其还包括基于所述竞争测定数据的分析，建立配对重链多肽和轻链多肽的LCCA文库。38.一种量化与重链多肽配对的轻链多肽的选择性的高通量方法，其包括以下步骤：(a)共表达一...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾森·巴德斯内斯，毛伦·奥康诺麦考特，安德斯·奥尔恩，亚当·路易斯·科珀，G·Y·K·吴，安托尼奥斯·萨米奥塔基斯，YC·周，
申请(专利权)人：酵活有限公司，加拿大国家研究委员会NRC，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA