一种抗炭疽芽孢杆菌PA抗原的全人源抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种抗炭疽芽孢杆菌PA抗原的全人源抗体，所述抗体通过克隆人源的抗炭疽PA抗原抗体的重链和轻链可变区基因，构建线性表达框，并转染于宿主细胞，通过对PA抗原结合活性和中和活性的筛选而获得。本发明专利技术公开的抗体对炭疽芽孢杆菌PA抗原具有高结合活性和中和活性，能够为攻毒后的机体提供优异的保护效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种全人源抗体，属于分子生物学和免疫学领域。
技术介绍
炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的一种人畜共患的烈性传染病，它不仅仅是食草动物的主要疾病，所有的哺乳动物，包括人类，都很容易发生。根据感染途径不同，人类炭疽分为皮肤炭疽、胃肠炭疽和吸入性炭疽三种原发类型。肺炭疽病死率在我国法定报告的传染病中位居前十位，被列为甲类传染病进行管理。炭疽杆菌芽孢作为一种潜在的生物战剂和生物恐怖制剂，一直为各国所重视。近年来随着国际反恐斗争的发展，对炭疽的防护研究已成为国际生物医学界的研究热点之一。炭疽芽孢杆菌主要以孢子形式存在。孢囊具有保护功能，能使细菌不受阳光、热和消毒剂的破坏而在自然界中长期存活。炭疽的主要致病因子包括三种蛋白构成的炭疽毒素和以γ键相联结的聚-D-谷氨酰荚膜，荚膜能阻止细菌被宿主免疫细胞吞噬，而毒素是造成宿主损伤和死亡的主要原因。炭疽杆菌分泌的炭疽毒素由三种蛋白组成，分别是保护性抗原(PA)，水肿因子(EF)和致死因子(LF)。其中，PA在炭疽杆菌侵染过程中起着至关重要的作用。它首先和人体细胞表面的受体(TEM8或CMG2)结合，由位于细胞膜上的FURIN蛋白酶切除其氨基端20kDa片段PA20形成PA的活性片段PA63，该片段发生寡聚化在膜上形成七聚体。LF和EF结合七聚体形成复合物，通过受体介导的内吞进入细胞。在内吞小体酸性pH的环境下，PA七聚体发生构象改变，形成一个管道，使EF和LF进入胞液，分别发挥毒性作用。这三个蛋白本身都是无毒的，但PA与LF结合称为致死毒素(Lethal Toxin，LT)，LF具有金属依赖的蛋白酶活性，目前已发现的底物均属于丝裂原激活的蛋白激酶的激酶家族(MAPKKS)，经过一系列未知的级联反应可导致细胞裂解与死亡；PA和EF的混合物称为水肿毒素ET(Edema Toxin)，EF具有钙调蛋白依赖的腺苷酸环化酶活性，可使靶细胞内cAMP浓度升高，导致宿主防御能力下降。炭疽的医学防护措施主要有预防和治疗二大方面。目前有效的预防措施主要是接种炭疽疫苗，PA能诱导机体的保护性免疫，是目前唯一获美国食品和药品管理局(FDA)批准的人用炭疽疫苗(Anthrax Vaccine Adsorbed，AVA)的主要免疫活性成分；但需事先1-2月免疫接种才能为人员提供免疫防护。生物战/生物恐怖活动的突发性使得常规主动免疫难以满足其时间要求，有效的治疗方法是对抗炭疽攻击必不可少的措施。治疗策略主要有二大类：一类是炭疽杆菌的抑菌剂或杀菌剂，其中包括抗生素和噬菌体的溶菌成分；另一类是依据炭疽病理模型设计的毒素抑制剂，主要包括炭疽毒素中和抗体、可溶性受体、毒素突变体和小分子拮抗剂。目前炭疽的治疗主要依靠抗菌素，多种抗菌素对炭疽有效，但如出现以下情况，临床上往往不能奏效：①未能及时服用抗菌素：抗菌素一般需要在机体接触炭疽芽孢后的48小时内使用，即繁殖体阶段使用，可以有效治疗，但炭疽感染的潜伏期可以持续数小时甚至几天，这一阶段的症状表现类似流感，易误诊，错过最佳治疗时机；②人体耐药性：抗生素滥用使部分人群对多种抗生素产生抗药性，一些个体对许多抗菌素已产生抗药性，使得抗菌素治疗无效；③炭疽杆菌人为改构：将抗生素抗性基因导入炭疽杆菌使抗生素失效，在技术上已完全可能(前苏联曾研制出具有18种抗生素抗性的超级炭疽杆菌)。抗生素在繁殖体阶段若不能有效阻断炭疽感染，一旦进入毒素阶段，抗生素就毫无作用。抗菌素对吸入性炭疽的治疗虽然有效，但必须在感染初期立即使用。抗菌素只能杀死人体组织内的部分孢子和细菌，却不能抵抗孢子和细菌在体内产生的大量毒素。而在感染晚期由于毒素的大量产生，仍会导致患者死亡。目前国外的研究主要集中在发现能抵抗炭疽毒素的药物方面，包括中和单抗、可溶性受体、PA突变体和小分子抑制剂等。中和抗体因具有保护性高，在人体内可以发挥特有的补体依赖细胞毒作用(CDC)和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)，半衰期长，性质稳定等优点，尤其将中和抗体与抗生素联合应用时，可以相互弥补，最大可能发挥治疗作用，因此中和抗体已成为目前最有前景的炭疽治疗药物。已有的研究表明，抗LF/EF抗体能阻断LT/ET发挥活性，保护动物抵抗炭疽毒素或者炭疽芽孢的攻击。但是无论是被动免疫还是治疗，效果均不及抗PA抗体。抗PA中和性抗体的作用要比针对炭疽毒素其他组分的中和性抗体更加重要。在感染初期，因荚膜表面有PA的存在，抗PA抗体能与芽孢结合，增强巨噬细胞的吞噬作用，抑制出芽或通过氧化杀死正在出芽的芽孢，因此，抗PA抗体具有抗芽孢的活性。芽孢被巨噬细胞吞噬后，导致巨噬细胞裂解，释放繁殖体，并伴有一定量的PA，LF及EF的分泌表达，蛋白酶水解PA，装配成七聚体，结合LF和EF后内吞入细胞发挥毒素作用。抗PA抗体可以通过抑制PA装配或与细胞结合来发挥作用。研究显示，针对炭疽PA的单克隆抗体能够保护细胞免受炭疽毒素和炭疽芽孢杆菌的攻击，特别是对吸入性炭疽具有保护作用。单克隆抗体按照种属来源可分为：鼠源性(Murine)、嵌合(Chimeric)、人源化(Humanized)和全人源单抗(Human Monoclonal Antibody)。目前鼠源性单抗存在半衰期短、免疫原性强等问题，可诱导产生人抗鼠抗体，毒副作用明显，大大制约了其临床应用，已经逐渐退出市场；嵌合抗体和人源化抗体虽然免疫原性较弱，但是费用昂贵，过程繁复，不定因素多；并且人源化抗体构建过程中为保持抗体活性，抗体序列需要一定程度的回复突变(Back Mutation)，因此仍存在一定的免疫原性。而全人源单克隆抗体不存在鼠源性异种蛋白的抗原性，可以直接用于医疗，具有免疫原性低、半衰期长、安全有效等优点。近年来随着转基因小鼠、展示技术、单细胞PCR等全人源单抗制备技术的发展成熟，国外大多数新开发项目已转向全人源单抗的制备。因此本专利技术的目的就是提供使用安全系数高，具有优异保护效果，针对不同PA中和表位及中和机制的抗炭疽PA毒素的全人源单克隆抗体。
技术实现思路
基于上述专利技术目的，本专利技术通过克隆人源的抗炭疽PA抗原抗体的重链和轻链可变区基因，构建线性表达框，并转染于宿主细胞，通过对PA抗原结合活性和中和活性的筛选，提供了一系列的抗炭疽芽孢杆菌PA抗原的全人源抗体，所述抗体的重链可变区的CDR1、2、3区氨基酸序列和轻链可变区的CDR1、2、3区氨基酸序列选自下列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗炭疽芽孢杆菌PA抗原的全人源抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的CDR 1、2、3区氨基酸序列和轻链可变区的CDR 1、2、3区氨基酸序列选自下列序列组合：(1)SEQ ID NO:1、2、3和SEQ ID NO:6、7、8；(2)SEQ ID NO:11、12、13和SEQ ID NO:16、17、18；(3)SEQ ID NO:21、22、23和SEQ ID NO:26、27、28；(4)SEQ ID NO:31、32、33和SEQ ID NO:36、37、38；或者(5)SEQ ID NO:41、42、43和SEQ ID NO:46、47、48。

【技术特征摘要】
1.一种抗炭疽芽孢杆菌PA抗原的全人源抗体，其特征在于，所述抗
体的重链可变区的CDR 1、2、3区氨基酸序列和轻链可变区的CDR 1、2、
3区氨基酸序列选自下列序列组合：
(1)SEQ ID NO:1、2、3和SEQ ID NO:6、7、8；
(2)SEQ ID NO:11、12、13和SEQ ID NO:16、17、18；
(3)SEQ ID NO:21、22、23和SEQ ID NO:26、27、28；
(4)SEQ ID NO:31、32、33和SEQ ID NO:36、37、38；或者
(5)SEQ ID NO:41、42、43和SEQ ID NO:46、47、48。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链和轻链
的可变区氨基酸序列选自下列序列组合：
(1)SEQ ID NO:4和9；
(2)SEQ ID NO:14和19；
(3)SEQ ID NO:24和29；
(4)SEQ ID NO:34和39；或者
(5)SEQ ID NO:44和49。
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链恒定区
氨基酸序列为SEQ ID NO:51所示，所述抗体的轻链恒定区氨基酸序列为
SEQ ID NO:53，但当所述重链和和轻链的可变区氨基酸序列为SEQ ID 
NO:14和19的组合时，所述抗体的轻链恒定区氨基酸序列为SEQ ID 
NO:55。
4.一种抗体组合物，其特征在于，所述组合物含有至少两种权利要求
3所述的抗体，以及制药学上可接受的载体。
5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈薇，于长明，迟象阳，李建民，徐俊杰，刘威岑，宋小红，张军，张晓鹏，付玲，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11