本发明专利技术公开了黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白（Bb?toxin）、截短片段及其重组表达载体和应用，黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，其截短片段如SEQ?ID?NO.8所示，家蚕幼虫添食截短片段后家蚕存活率明显下降（约30%），表明该基因编码的是一个可导致鳞翅目昆虫家蚕致死的毒性蛋白，能够用于制备抗鳞翅目害虫的生物农药杀虫剂，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白、截短片段及其重组表达载体和应用
本专利技术属于生物化学领域，具体涉黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白(Bbtoxin)和黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段，还涉及含黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白的重组表达载体和应用。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白(Bt Cry)对鳞翅目(L印idoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)等多种昆虫具有杀虫活性。Bt Cry基因导入烟草和番茄并表现出抗虫特性后，又相继获得抗虫转基因的玉米、水稻、马铃薯、甘蓝、棉花、杨树等。以我国的转基因棉花为例，每年带来的直接经济效益达150亿元，每亩增收节支150元左右，减少化学农药用量2000-3000万公斤。但长期使用Bt Cry转基因作物也导致抗性昆虫的相继产生，如棉铃虫(Helicoverpa armigeraHubner)、小菜蛾(Plutellaxylostella)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等。早在2007年,科研工作者采用两种不同类型的Bt Cry协同组合使用来应对抗性昆虫的蔓延，这种方式虽然在一定程度上可以延缓Bt Cry抗性昆虫的产生,但没有从根本上解决问题,还会出现对Bt Cry更高抵抗性的害虫，最终促使Bt Cry应用于作物防虫的价值消失，有可能导致农业昆虫灾害的新一轮大爆发。因此，从其它物种的基因组中鉴定新的与抗虫害相关的基因，应用于作物的分子育种，缓解或替代害虫对转Bt作物的抗性是当前农业迫切需要解决的科学问题。黑胸败血芽孢杆菌(Bacillus bombyseptieus,简称Bb)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌，对昆虫具有强烈致病性，但对其致病机制研究报道较少。16s rRNA进化分析表明Bb与Bt在进化上具有较近的亲缘关系；参与Bt致病的相关基因都不同程度地被Bb诱导表达且其表达模式与Bt类似，暗示Bb可能具有类似于Bt的致病机制；另外，Bb类似于Bt，在形成芽孢的同时也能产生蛋白性质的伴孢晶体毒素，而Bb感染后在中肠上形成孔洞，暗示Bb伴孢毒素蛋白具有类似于Bt Cry的重要的生物学功能。因此，对Bb伴孢晶体毒素蛋白的鉴定和全长序列克隆，将在对阐明Bb毒素蛋白致病性和致病机理产生重要的理论价值和实践意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段，本专利技术的目的之二在于提供上述截短片段的编码基因；本专利技术的目的之三在于提供黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白；本专利技术的目的之四在于提供黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白的编码基因；本专利技术的目的之五在于提供含有所述编码基因的重组表达载体；本专利技术的目的之六在于提供含有所述重组表达载体的工程菌；本专利技术的目的之七在于提供黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段或黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白的应用。1.黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段，所述截短片段的氨基酸序列如SEQ ID N0.8 所示。2.所述黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段的编码基因。优选的，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示。3.黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。4.所述黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白的编码基因。优选的，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。5.含有所述编码基因的重组表达载体。优选的，所述重组表达载体是将SEQ ID N0.7所示的核苷酸连入pET28a载体的Nde I和Xho I酶切位点处。6.含有所述重组表达载体的工程菌，优选的工程菌为大肠杆菌BL21。7.所述黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段或所述黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白在制备抗鳞翅目害虫的生物农药杀虫剂中的应用。优选的，所述鳞翅目害虫为家蚕。本专利技术的有益效果在于:本专利技术从病原微生物黑胸败血芽孢杆菌中分离到一个导致家蚕幼虫致死的伴孢晶体毒素蛋白，并克隆到编码该蛋白的基因，还获得一个具有活性的伴孢晶体毒素蛋白截短片段，家蚕幼虫经口添食该截短片段后可导致家蚕死亡，因此伴孢晶体毒素蛋白及其截短片段是除Bt Cry伴孢晶体毒素蛋白外唯一一个经口饲养家蚕可导致家蚕死亡的伴孢晶体毒素蛋白，这将为抗鳞翅目害虫的生物农药杀虫剂提供新的靶标。【附图说明】为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图:图1为分离纯化获得的黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白(M:标准蛋白Marker ；1:纯化获得的黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白)。图2为黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白与不同类型的Bt Cry毒素蛋白进化分析(Bt CrylAa (Genbank:AAA22353.1) ；Bt Cry2Aa (Genbank:AAA22335.1)；Bt Cry3Aa (Genbank:AAA22336.1) ；Bt Cry4Aa (Genbank:CAA68485.1)；Bt Cry5Aa (Genbank:AAA67694.1) ；Bt Cry6Aa (Genbank:AAA22357.1)；Bt Cry7Aa (Genbank:AAA2235I.I) ； B t Cry8Aa (Genbank:AAA2111 7.1)；Bt Cry9Aa (Genbank:CAA41122.1 ) ；Bt CrylOAa (Genbank:AAA22614.1 )；Bt CryllAa (Genbank:AAA22352.1) ；Bt Cryl2Aa (Genbank:AAA22355.1)；Bt Cryl3Aa (Genbank:AAA22356.1 ) ； Bt Cryl4Aa ( Genbank:AAA215163.1)；Bt Cry 15Aa (Genbank:AAA22333.1) ；Bt Cry16Aa (Genbank:CAA63860.1) ；BtCryl7Aa (Genbank:CAA67841.1) ；Bt Cryl8Aa (Genbank:CAA67506.1) ；Bt Cryl9Aa(Genbank:CAA68875.1) ;Bt Cry20Aa (Genbank:AAB93476.1))。图3为黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白在BL21中诱导表达电泳检测(1:对照沉淀；2:对照上清；3:16°C诱导20h沉淀；4:16°C诱导20h上清；5:37°C诱导4h沉淀；6:37°C诱导4h上清)。图4为黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段在BL21中诱导表达电泳检测(1:对照沉淀；2:对照上清；3:16°C诱导20h沉淀；4:16°C诱导20h上清；5:37°C诱导4h沉淀；6:37°C诱导4h上清)。图5为SDS-PAGE电泳检测Ni柱亲和层析纯化获得黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段。图6为家蚕添食黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段结果(A:存活率统计结果，其中I为添食等体积PBS的家蚕存活率；2为添食黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段的家蚕存活率:添食PBS后家蚕存活照；C:添食黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒本文档来自技高网...
【技术保护点】
黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段，其特征在于：所述截短片段的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.8所示。
【技术特征摘要】
1.黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段，其特征在于:所述截短片段的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示。2.权利要求1所述黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于:核苷酸序列如SEQID N0.7所示。4.黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白，其特征在于:氨基酸序列如SEQID N0.4所示。5.权利要求4所述黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白的编码基因。6.根据权利要求5所述的编码基...
【专利技术属性】
技术研发人员：程廷才，林平，金盛凯，常怀谱，夏庆友，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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