一种检测炭疽芽孢杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测炭疽芽孢杆菌的方法。本发明专利技术提供了一种用于定量检测蜡样芽孢杆菌RSVF1的试剂盒，包括PlyG蛋白；所述试剂盒的用途为如下（a）或（b）：（a）定量检测蜡样芽孢杆菌RSVF1；（b）定量检测炭疽芽孢杆菌。所述PlyG蛋白为如下（1）或（2）：（1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（2）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有裂解酶活性的由序列1衍生的蛋白质。本发明专利技术所建立的方法具备灵敏度高、特异性强、检测快速等优点，为特异性定量检测炭疽杆菌的研究及试剂盒开发奠定了基础。对特异定量检测炭疽杆菌的研究提供了有力的理论支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
炭疽是严重威胁人类健康的烈性传染病，其病原体为炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)。由于其高毒性，炭疽杆菌是一种潜在的生物武器，曾被帝国主义作为致死战剂之一。目前，皮肤炭疽在我国各地还有散在发生，不应放松警惕。因此，发展快速、灵敏的炭疽杆菌检测方法具有重要意义。卩遼菌体裂解酶(bacteriophagelysins)是卩遼菌体在感染宿主菌末期表达的蛋白质，它通过水解细菌细胞壁的肽聚糖使子代噬菌体释放。Y噬菌体裂解酶(PlyG)能够特异性地杀死炭疽杆菌，同时也能够裂解蜡样芽孢杆菌RSVFl菌株，且RSVFl菌株是唯一对PlyG敏感的蜡样芽孢杆菌菌株。Miri Yemini等人就曾以RSVFl菌株为模型，研究了基于噬菌体的炭疽杆菌检测方法。李曼等人也RSVFl菌株为模型进行了杀灭试验的相关研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术提供了一种用于定量检测蜡样芽孢杆菌RSVFl的试剂盒，包括PlyG蛋白；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b): (a)定量检测蜡样芽孢杆菌RSVFl ； (b)定量检测炭疽芽孢杆菌。所述PlyG蛋白为如下(I)或(2): (I)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有裂解酶活性的由序列I衍生的蛋白质。所述试剂盒还可包括Iuc蛋白。所述Iuc蛋白为如下(3)或(4):(3)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(4)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有荧光素酶活性的由序列3衍生的蛋白质。所述试剂盒还可包括D-荧光素。所述试剂盒还可包括Profile-13560 (10X) ATP微生物快速检测系统。所述试剂盒还可包括记载有如下公式的载体:y=l.2587X-3.2879，x代表蜡样芽孢杆菌RSVFl总数以10为底的对数值，y代表发光值以10为底的对数值。所述试剂盒还可包括记载有如下公式的载体:y=l.2587X-3.2879，x代表炭疽芽孢杆菌总数以10为底的对数值，y代表发光值以10为底的对数值。本专利技术还保护以上任一所述的试剂盒在定量检测蜡样芽孢杆菌RSVFl中的应用。应用以上所述试剂盒检测蜡样芽孢杆菌RSVFl时，每个反应可以采用50 μ I D-荧光素/荧光素酶混合溶液、50 μ I PlyG蛋白浓度为0.09mg/ml的PlyG蛋白稀释液和50 μ I待测菌液。本专利技术还保护以上任一所述的试剂盒在定量检测炭疽芽孢杆菌中的应用。应用以上所述试剂盒检测炭疽芽孢杆菌时，每个反应可以采用50 μ I D-荧光素/荧光素酶混合溶液、50 μ I PlyG蛋白浓度为0.09mg/ml的PlyG蛋白稀释液和50 μ I待测菌液。本专利技术还保护所述PlyG蛋白在制备定量检测蜡样芽孢杆菌RSVFl的试剂盒中的应用。本专利技术还保护所述PlyG蛋白在制备定量检测炭疽芽孢杆菌的试剂盒中的应用。目前以ATP生物发光法定量检测细菌的研究往往采用细胞裂解液来裂解细菌从而释放ΑΤΡ，大多不具有特异性和专一性。本专利技术以噬菌体裂解酶(PlyG)和荧光素酶(Iuciferase)为关键工具，以蜡样芽孢杆菌RSVFl为模型，建立了荧光发光值与细菌数量之间的线性关系且二者相关性显著(R2=0.9898)。本专利技术所建立的方法具备灵敏度高、特异性强、检测快速等优点，为特异性定量检测炭疽杆菌的研究及试剂盒开发奠定了基础。对特异定量检测炭疽杆菌的研究提供了有力的理论支持。附图说明图1 为 PCR 扩增得到的 PlyG、Iuc 基因片段；M:BM2000DNA Marker ；1 =PlyG 基因片段；2:luc基因片段。图2为重组质粒pET22b_PlyG和重组质粒pET_luc的双酶切鉴定结果；Ml:BM2000DNA Marker ；1: 重组质粒pET22b_PlyG的双酶切鉴定结果；2:重组质粒pET22b_luc的双酶切鉴定结果；M2:1kb Ladder DNA Marker。图3为SDS-PAGE检测裂解酶与荧光素酶的表达纯化结果；Ml:蛋白质Marker (低)；M2:蛋白质Marker (宽)；1:将质粒pET22b (+)导入大肠杆菌BL21 (DE3)得到的对照菌进行步骤4得到的上清液；2:重组菌甲步骤4得到的上清液；3:纯化后的PlyG蛋白液；4:重组菌乙步骤4得到的上清液；5:纯化后的Iuc蛋白液。图4为裂解酶的酶活性检测。图5为以平板计数的细菌总数的对数值为X轴，以发光值的对数值为Y轴，制作的X、Y散点图描绘关系曲线。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。裂解酶(又称PlyG蛋白)如序列表的序列I所示，其cDNA的开放阅读框如序列表的序列2所示。荧光素酶(又称Iuc蛋白)如序列表的序列3所示，其cDNA的开放阅读框如序列表的序列4所示。限制性内切酶Nde1、EcoRI_HF和T4DNA连接酶购自NEB公司。2XTransTaq HiFiPCR SuperMixII购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司；DNA Marker、Protein Marker和质粒提取试剂盒均购自北京博迈德生物技术有限公司。BHI(Brain Heart Infusion)培养基购自美国BD医疗器械有限公司。蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus) RSVFl =ATCC编号为4342 ;参考文献:A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis, RaymondSchuch,Daniel Nelson&Vincent A.Fischetti， NATURE|V0L418|22AU⑶ST2002， www.nature, com/nature,884-889。质粒pET22b(+):购自 Novagen 公司，产品编号:69744-3。大肠杆菌BL21 (DE3):北京全式金生物技术公司。突光素酶检测试剂盒:购自Promega公司，产品目录号:E1500。D-突光素(Beetle Luciferin, Potassium Salt):购自 Promega 公司，产品目录号为 E1601。Profile-13560 (10X) ATP微生物快速检测系统:购自北京浩正智信科技有限公司。实施例1、裂解酶和荧光素酶的制备一、重组质粒的构建1、重组质粒pET22b_PlyG的 构建 (I)合成序列表的序列2所示的双链DNA分子，将合成的双链DNA分子作为模板，用PlyG-F和PlyG-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1的泳道I。PI yG-F: 5，-GGAATTCCATATG |CATCACCATCACCATCAC[ ATGGAAATCCAA-3，；PIyG-R本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于定量检测蜡样芽孢杆菌RSVF1的试剂盒，包括PlyG蛋白；所述试剂盒的用途为如下（a）或（b）：（a）定量检测蜡样芽孢杆菌RSVF1；（b）定量检测炭疽芽孢杆菌；所述PlyG蛋白为如下（1）或（2）：（1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（2）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有裂解酶活性的由序列1衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张博，米志强，安小平，张飞雄，童贻刚，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：