本发明专利技术公开了黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白及其重组表达载体和应用，黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，家蚕幼虫添食黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白后导致家蚕存活率降低，表明该基因是一个可导致鳞翅目昆虫家蚕致死的毒性蛋白，能够用于制备生物农药杀虫剂，特别是抗鳞翅目害虫的生物农药杀虫剂，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白及其重组表达载体和应用
本专利技术属于生物化学领域，具体涉及黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白，还涉及含黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的重组表达载体和应用。
技术介绍
细菌是植物、动物和人类的主要病原微生物之一，而毒素蛋白是其重要的毒力因子，主要类型为穿孔毒素蛋白(Pore-forming toxins,简称:PFT)。大多数细菌的PFT作用于宿主的细胞膜，形成孔洞使细胞内外离子平衡，导致细胞裂解破碎而死亡。目前已鉴定的细菌穿孔毒素蛋白超过300多种，根据其插入细胞膜磷脂双分子层的结构特征，可以分为a-PFT和β-PFT。其中β-PFT又可以分为smalP-PFT和CDCs两种类型，它们的结合细胞方式、孔道形成机制和引起靶细胞反应不同。尽管有如此之多的细菌PFT，但由于绝大多数的PFT经口添食不会导致昆虫死亡，所以真正在作物抗虫方面有利用价值的并不常见。目前只有a-PFT的Bt Cry伴孢晶体毒素蛋白和β-PFT的Bt Cyt δ内毒素在生物农药杀虫剂或抵抗害虫的转基因植物分子育种等方面有产业上的应用。尽管转Bt植物品种的大面积推广应用极大地减轻了虫害，也减少了农药用量，并在保护环境的同时也挽回了大量的经济损失；但长期使用同一抗性品种也导致了对Bt Cry伴孢晶体毒素蛋白具有抗性的昆虫相继出现。因此寻找新的靶标基因培育新的抗性品种迫在眉睫，但如何从数以万计的病原微生物中鉴定出可以经口添食感染导致昆虫死亡的穿孔毒素蛋白明显非常困难。黑胸败血芽孢杆菌(Bacillus bombyseptieus,简称Bb)是鳞翅目模式昆虫家蚕的主要细菌性病原之一，Bb感染家蚕后，在家蚕中肠组织中形成孔洞，进而通过这些孔洞侵入血淋巴引起家蚕细菌性败血病。有学者通过电镜扫描观察到家蚕中肠上皮在Bb感染后有孔洞形成，暗示Bb产生了穿孔毒素蛋白·且家蚕在感染Bb后会很快死亡，表明Bb的穿孔毒素蛋白具有重要的生物学功能。因此，对该基因进行克隆进而对其生物学功能进行研究，将为新的生物杀虫剂的开发奠定基础。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白，本专利技术的目的之二在于提供黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的编码基因；本专利技术的目的之三在于提供含有上述编码基因的重组表达载体，本专利技术的目的之四在于提供含有重组表达载体的工程菌；本专利技术的目的之五在于提供利用所述工程菌制备黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的方法，本专利技术的目的之六在于提供黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白在制备生物农药杀虫剂中的应用。1.黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。2.权利要求1所述黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的编码基因。优选的，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。3.含有所述编码基因的重组表达载体。优选的，所述重组表达载体是将SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列连入pET28a载体的BamH I和Xho I酶切位点而得。4.含有权利要求4或5所述重组表达载体的工程菌。优选的，所述工程菌为大肠杆菌BL21。5.利用所述工程菌制备黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的方法，将工程菌扩大培养后加入IPTG诱导表达，离心收集菌体，PBS清洗后用液氮反复冻融，然后超声波破碎收集沉淀；沉淀分别用含质量分数为0.5%的Triton TM X_100、0.1~0.3Mm EDTA的PBS和含2M尿素、IOOmM NaCl的PBS清洗；再用含8M尿素、IOOmM NaCl的PBS重悬沉淀，使包涵体充分溶解；离心收集上清，抽滤，滤液含有尿素的PBS进行透析；最后用PBS溶液透析，然后用Ni亲和柱纯化，用PBS溶液和含有20mM咪唑的PBS洗去未结合的蛋白后，再分别用含200mM、500mM和IM咪唑的PBS洗脱，最后用PBS溶液透析，得黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白。6.所述黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白在制备生物农药杀虫剂中的应用。优选的，所述黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白在制备抗鳞翅目害虫的生物农药杀虫剂中的应用。本专利技术的有益效果在于:本专利技术克隆得到了黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白Bbtoxin-2,经口添食Bb toxin-2毒素蛋白后可导致家蚕死亡,该蛋白是除Bt Cry伴孢晶体毒素蛋白外唯--个经口饲养家蚕可导致家蚕死亡的毒素蛋白，这将为开发新的生物农药杀虫剂提供新的思路。【附图说明】`为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图:图1为黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白在BL21中诱导表达电泳检测(1:对照沉淀；2:对照上清；3:16°C诱导20h沉淀；4:16°C诱导20h上清；5:37°C诱导4h沉淀；6:37°C诱导4h上清)。图2为黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白原核表达纯化SDS-PAGE电泳检测。图3为4龄起家蚕添食Bb toxin-2生存率统计(1:添食等体积PBS的家蚕存活率；2:添食Bb toxin-2毒素蛋白的家蚕存活率)。图4为5龄期家蚕分别添食黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白、PBS和非致病钙粘蛋白CR12的结果(A:5龄期家蚕添食黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白生存率统计；B:添食PBS后家蚕存活照片；C:添食非致病钙粘蛋白CR12后家蚕存活照片；D:添食Bb toxin-2毒素蛋白后家蚕死亡照片)。【具体实施方式】下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、穿孔毒素蛋白Bb toxin-2的鉴定和克隆从NCBI上下载目前已报道的α-PFT和β-PFT的蛋白质序列，具体如下:嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)气单胞菌溶素(Aerolysin) (Genbank:AECl2846.1)、腐败梭菌(Clostridium septicum) α 毒素(Alpha-toxin) (Genbank:AAB32892.1)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) α 毒素(Alpha-toxin) (Genbank:Ρ09616.2)、产胺链球菌(Streptococcus pyogenes)溶血性链球菌产生的溶血素O (StreptolysinO) (Genbank:Q53957.1)、炭疽杆菌 str.A0174 (Bacillus anthracis str.A0174)anthrolysin O (ALO) (Genbank:EDT69040.1)、单核增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)李斯特菌溶血素(Listeriolysin O) (Genbank:P13128.1)、蜂房芽胞杆菌(Paenibacillus alvei)蜂房杆菌溶素(Alveolysin) (Genbank:Ρ23564.I)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)炭疽毒素(Anthrax toxins) (Genbank:ΝΡ_052806.I)、苏云金芽抱杆菌(Bacillus thuringiensis) Bt CrylAa (Genban本文档来自技高网...
【技术保护点】
黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。
【技术特征摘要】
1.黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白，其特征在于:氨基酸序列如SEQID N0.4所示。2.权利要求1所述黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于:所述编码基因的核苷酸序列如SEQID N0.3 所示。4.含有权利要求2所述编码基因的重组表达载体。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组表达载体是将SEQIDN0.3所示的核苷酸序列连入pET28a载体的BamH I和Xho I酶切位点而得。6.含有权利要求4或5所述重组表达载体的工程菌。7.根据权利要求6所述工程菌，其特征在于:所述工程菌为大肠杆菌BL21。8.利用权利要求7所述工程菌制备黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的方法，其特征在于:将工程菌用IPTG诱导表达，离心收集菌体，PBS清洗后用液...
【专利技术属性】
技术研发人员：程廷才，林平，金盛凯，常怀谱，夏庆友，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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