一种大豆耐盐性的检测方法技术

本发明专利技术提供一种大豆耐盐性的检测方法，具体为：首先提取待测大豆基因组DNA，再分别以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，对大豆基因组DNA进行PCR扩增，对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收PCR扩增产物；然后利用限制性内切酶XbaI对回收的PCR扩增产物进行酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若酶切产物为324bp的DNA片段，则待测大豆为耐盐大豆；若酶切产物为280bp和40bp的两个DNA片段，则待测大豆为盐敏感大豆；本发明专利技术是利用Glyma.03g171500基因起始密码子上游‑643位核苷酸进行甄别，在大豆苗期就可以利用该分子标记对大豆耐盐性进行鉴定，结果准确，操作简便，大大提高育种效率，在实际育种和生产中具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及大豆耐盐育种和分子生物学
，特别是一种大豆耐盐性的检测方法。
技术介绍
我国盐渍化土壤分布广泛，总面积高达两亿亩。目前由于环境持续恶化和不合理耕作等原因，盐渍化土壤面积仍不断增加。同时由于近年来粮食压力的增大和可用耕地面积的持续减少，盐渍化土壤成为我国耕地的重要后备土地资源，但是土壤盐渍化严重影响作物生长进程和产量水平，大大限制了盐渍化土壤的快速改良和有效利用。大豆是我国重要的粮食作物和油料作物，在大豆五大主产区均存在不同程度的土壤盐渍化的问题。大豆属于中度耐盐作物，在盐害胁迫下大豆产量和品质受到很大影响。我国蕴藏着大量的大豆种质资源以及丰富优异等位变异，因此选育耐盐品种对于促进盐渍土地的有效利用和实现大豆高产稳产具有重要的理论意义和实践价值。目前大豆耐盐性鉴定主要依靠育种者在盐渍条件下对大豆不同生育期的耐盐特性调查进行判断，鉴定结果易受外界环境影响。因此，耐盐性大豆遗传育种迫切需要寻找一种不受环境条件及生育期限制并且能够快速准确进行大豆耐盐性鉴定方法。分子标记辅助选择在DNA水平上对不同大豆种质及大豆耐盐育种后代的耐盐性进行检测，该方法可以在大豆苗期进行，从而加快耐盐大豆育种进程。目前可用于大豆耐盐性鉴定的分子标记较少，郭培等(中国农业科学33:10-16，2000)开发一个共显性的PARD分子标记，可以鉴定耐盐大豆个体(700bp)和敏盐大豆个体(600bp)，该标记在锦豆33×Hark以及铁峰8号×早熟6号两个F2群体中得到验证(郭培等，2002，大豆科学，21:56-61)；田蕾(2008中国农业科学院硕士论文)将前期开发的RAPD标记转化为SCAR标记，SCAR的使用增强了RAPD标记的特异性并简化PCR分析；张孟臣(专利申请号201210538634.3)开发一对引物可以用于冀豆12号与冀NF58的杂交组合后代的耐盐性鉴定和筛选。然而大豆耐盐性状为多基因控制的数量性状，仅靠现有的这些耐盐分子标记对大量的大豆种质耐盐性进行鉴定是远远不够的，因此急需开发和补充新的可用于育种实践中的有效分子标记。GmNcl1基因(Glyma.03g171500)与拟南芥的CHXs家族亲缘关系较近，AtCHX21编码拟南芥的一个Na+/H+反向转运蛋白，在调节根木质部Na+浓度发挥重要作用，该基因被敲除后拟南芥植叶片和木质部中的Na+含量降低(2006Hall et al.Journal of Experimental Botany Vol.57,No.5,pp.1201-1210)。对GmNcl1基因表达模式进行分析发现该基因受盐胁迫诱导表达上调，并且盐敏感大豆85-140较耐盐品种铁峰8号的Ncl1上调表达幅度更大，说明该基因为大豆耐盐相关基因(2014赫卫等，中国农业科学47(3):411-421)；赫卫等(2014)对50个不同耐盐性大豆品种的Glyma.03g171500基因启动子及基因序列拼接获得的序列进行聚类分析，发现耐盐品种和盐敏感品种之间存在特定的单倍型GAGATATTC(耐)/TTT----CT(敏)序列。CAPS是酶切扩增多态性序列标记技术，是特异引物的PCR扩增产物与限制性内切酶相结合而产生的一种DNA分子标记，它揭示了特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点的变异信息。具有共显性、位点特异性、操作简单和成本低的特点。目前，基于Glyma.03g171500基因的DNA序列差异的大豆耐盐性检测方法尚未见报道。
技术实现思路
针对上述问题，本申请根据不同大豆品种Glyma.03g171500基因的DNA序列差异，将其开发成CAPS分子标记，通过PCR扩增及电泳技术将DNA水平上遗传多态性出来，该方法简便快速，检测结果直观易区分，本专利技术是这样实现的：一种大豆耐盐性的检测方法，其具体步骤如下：A)提取待测大豆基因组DNA；B)分别以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，对大豆基因组DNA进行PCR扩增；然后对反应产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，再回收PCR扩增产物；C)利用限制性内切酶XbaI对回收的PCR扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳检测；若酶切产物为324bp的DNA片段，则待测大豆为耐盐大豆；若酶切产物为280bp和40bp的两个DNA片段，则待测大豆为盐敏感大豆。优选的，本专利技术所述大豆耐盐性的检测方法中，步骤B)所述对大豆基因组DNA进行PCR扩增，是指：PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer 25μL、dNTP Mix(10mM each)1μL、上下游引物(10μM)各4μL、1U/μL的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL、20ng/μL的模板DNA4μL、ddH2O补足到50μL；PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。优选的，本专利技术所述大豆耐盐性的检测方法中，步骤C)所述利用限制性内切酶XbaI对PCR扩增产物进行酶切，具体是指：酶切体系：10×FastDigest Green Buffer 5μL、100ng/μL的DNA 25μL、1U/μL限制性内切酶XbaI 1μL、ddH2O补足到50μL；酶切条件：37℃温浴15min；反应结束后，65℃温浴20min以终止酶切反应。本专利技术中，SEQ ID NO.1为上游(正向)引物序列：CTCACAACTCACAATTGCCA；其是根据所述大豆基因组中Glyma.03g171500基因起始密码子上游-643位核苷酸的上游序列进行设计；SEQ ID NO.2为下游(反向)引物序列：GAGGCTACGTGCGCCTCTA；其是根据所述大豆基因组中Glyma.03g171500基因起始密码子上游-643位核苷酸的下游序列进行设计。本专利技术所提供的检测方法，主要为检测待测大豆的基因组中Glyma.03g171500基因起始密码子上游-643位核苷酸为C还是T(见SEQ ID NO.3)，利用限制性内切酶XbaI对待测大豆基因PCR扩增产物进行酶切，若酶切产物为324bp的DNA片段，则待测大豆为耐盐大豆；若酶切产物为280bp和40bp的两个DNA片段，则待测大豆为盐敏感大豆。将上述324bp的DNA片段回收双向测序发现其序列为SEQ ID NO.4，第30-33位核苷酸(ATAT)，且第45为核苷酸为T。将上述280bp的DNA片段回收测序，发现其序列为SEQ ID NO.3第45-324位序列(序列的第45为C)，测序结果与酶切结果一致。本专利技术利用Glyma.03g171500基因起始密码子上游-643位核苷酸设计特异性引物进行PCR扩增，再利用限制性内切酶XbaI对胶回收的PCR扩增产物进行酶切，通过对酶切产物的判断，在大豆苗期就可以利用该分子标记对大豆耐盐性进行鉴定，结果准确，操作简便，大大提高育种效率，在实际育种和生产中具有广阔的应用前景。附图说明图1为耐盐大豆(A清远小青豆)与盐敏感大豆(B邢阳灰黄豆)盐胁迫处理后的表型示意图；图2为PCR产物测序后比对结果示意图；图3为鉴定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大豆耐盐性的检测方法，其特征在于，步骤如下：A）提取待测大豆基因组DNA；B）分别以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，对大豆基因组DNA进行PCR扩增；然后对反应产物进行2.5%琼脂糖凝胶电泳，再回收PCR扩增产物；C）利用限制性内切酶XbaI对回收的PCR扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行2.5%琼脂糖凝胶电泳检测；若酶切产物为324bp的DNA片段，则待测大豆为耐盐大豆；若酶切产物为280bp和40bp的两个DNA片段，则待测大豆为盐敏感大豆。

【技术特征摘要】
1.一种大豆耐盐性的检测方法，其特征在于，步骤如下：A）提取待测大豆基因组DNA；B）分别以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，对大豆基因组DNA进行PCR扩增；然后对反应产物进行2.5%琼脂糖凝胶电泳，再回收PCR扩增产物；C）利用限制性内切酶XbaI对回收的PCR扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行2.5%琼脂糖凝胶电泳检测；若酶切产物为324bp的DNA片段，则待测大豆为耐盐大豆；若酶切产物为280bp和40bp的两个DNA片段，则待测大豆为盐敏感大豆。2.根据权利要求1所述大豆耐盐性的检测方法，其特征在于，步骤B）所述对大豆基因组DNA进行PCR扩增，是指：PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer 25μL、10mM each dNTP Mix1μL、浓度均为10μM的上下游...

【专利技术属性】
技术研发人员：宁丽华，邵宏波，张大勇，郭士伟，何晓兰，黄益洪，徐照龙，万群，刘佳，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32