一种多孢菌的制备方法技术

一种多孢菌的制备方法属于菌类制备技术领域，尤其涉及一种多孢菌的制备方法。本发明专利技术提供一种多孢菌代谢物的提取效果好、操作简便的制备方法。本发明专利技术包括以下步骤：1）将琼脂、葡萄糖、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、MgSO4·7H2O灭菌20min；2）将葡萄糖、MgSO4·7H2O、N-Z-AmineA、牛肉膏、酵母粉、灭菌20min。3）将葡萄糖、玉米浆、MgSO4·7H2O、棉籽蛋白、蛋白胨、麦芽糖、CaCO3灭菌20min；4）使用三角瓶，培养2天作为发酵所用的种子；5）发酵培养使用三角瓶，每瓶装发酵培养基接种子培养液，培养至对数期。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于菌类制备
，尤其涉及一种多孢菌的制备方法。
技术介绍
代谢组学是系统生物学研究的一部分，通过检测微生物细胞内所有代谢物的状态，代谢组学可以提供细胞在某一状态精确的表型。目前分子检测技术以及后基因组时代“组学”技术的发展促使代谢组学成为系统生物学研究的又一重要手段。微生物代谢组学的研究目标是针对微生物细胞内代谢物组的检测与分析。生命体细胞内的代谢过程非常活跃，某些代谢物转换时间非常短暂，通常在1-2s，因此，代谢物样品的过程对代谢组学的实验结果会造成巨大影响，甚至会导致错误结果的产生。一般微生物代谢组学样品的处理过程包括快速取样、灭活和代谢物的提取三个过程。刺糖多孢菌是一类革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，尤其是作为一种中性嗜盐菌，它能耐受11g/L的氯化钠，因此胞内渗透压极大，这进一步加大了代谢组学样品处理的难度。目前，还没有通用的代谢组学样品处理方法能够快速有效的将微生物胞内所有代谢物统一提取到提取液中,所以研究优化刺糖多孢菌代谢组学样品处理方法对其代谢组学方面的研究具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术就是针对上述问题，提供一种多孢菌代谢物的提取效果好、操作简便的制备方法。为实现上述目的，本专利技术包括以下步骤。1）将琼脂、葡萄糖、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、MgSO4·7H2O灭菌20min。2）将葡萄糖、MgSO4·7H2O、N-Z-AmineA、牛肉膏、酵母粉、灭菌20min。3）将葡萄糖、玉米浆、MgSO4·7H2O、棉籽蛋白、蛋白胨、麦芽糖、CaCO3灭菌20min。4）使用三角瓶，培养2天作为发酵所用的种子。5）发酵培养使用三角瓶，每瓶装发酵培养基接种子培养液，培养至对数期。作为一种优选方案，本专利技术所述琼脂，2g/L；葡萄糖，10g/L；酵母粉，3g/L；牛肉膏，1g/L；蛋白胨10g/L；MgSO4·7H2O，2g/L；N-Z-AmineA，30g/L；牛肉膏，2g/L；玉米浆，15g/L；棉籽蛋白，24g/L；；麦芽糖，2g/L；CaCO3，5g/L。作为另一种优选方案，本专利技术所述使用250mL三角瓶，每瓶装液30mL，置于30℃，200rpm下培养2天作为发酵所用的种子。发酵培养使用250mL三角瓶，每瓶装发酵培养基30mL，接1mL种子培养液，置于30℃75条件下，220rpm培养至对数期。另外，本专利技术还包括以下步骤。6）取10mL发酵液，用0.45μm微滤膜进行过滤，并用预冷至4℃的蒸馏水洗涤两次，抽干得到菌体，于液氮中保存备用。7）冷甲醇灭活刺糖多孢菌培养72h，将2mL发酵液用注射器喷入8mL预冷至-80℃的冷甲醇中，5000转离心2min，移除上清液，保存菌体于液氮中备用。本专利技术有益效果。本专利技术通过对刺糖多孢菌代谢组学样品处理过程的优化，建立了适于刺糖多孢菌代谢组学研究的样品处理方法。首先对刺糖多孢菌菌体的灭活方法进行了研究，通过考察快速过滤和冷甲醇淬灭两种常用的代谢组学细胞灭活方式，发现冷甲醇淬灭能快速灭活细胞并能使细胞快速定格在某一特定的生理状态，最终确定了冷甲醇淬灭作为刺糖多孢菌细胞灭活的方式。另外，还考察了冷甲醇提取，反复冻融和液氮研磨对刺糖多孢菌代谢物的提取效果。结果表明，液氮研磨更能有效地破碎刺糖多孢菌细胞，使胞内代谢物尽可能的释放到胞外。具体实施方式本专利技术包括以下步骤。1）将琼脂、葡萄糖、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、MgSO4·7H2O灭菌20min。2）将葡萄糖、MgSO4·7H2O、N-Z-AmineA、牛肉膏、酵母粉、灭菌20min。3）将葡萄糖、玉米浆、MgSO4·7H2O、棉籽蛋白、蛋白胨、麦芽糖、CaCO3灭菌20min。4）使用三角瓶，培养2天作为发酵所用的种子。5）发酵培养使用三角瓶，每瓶装发酵培养基接种子培养液，培养至对数期。所述琼脂，2g/L；葡萄糖，10g/L；酵母粉，3g/L；牛肉膏，1g/L；蛋白胨10g/L；MgSO4·7H2O，2g/L；N-Z-AmineA，30g/L；牛肉膏，2g/L；玉米浆，15g/L；棉籽蛋白，24g/L；；麦芽糖，2g/L；CaCO3，5g/L。所述使用250mL三角瓶，每瓶装液30mL，置于30℃，200rpm下培养2天作为发酵所用的种子。发酵培养使用250mL三角瓶，每瓶装发酵培养基30mL，接1mL种子培养液，置于30℃75条件下，220rpm培养至对数期。本专利技术还包括以下步骤。6）取10mL发酵液，用0.45μm微滤膜进行过滤，并用预冷至4℃的蒸馏水洗涤两次，抽干得到菌体，于液氮中保存备用。7）冷甲醇灭活刺糖多孢菌培养72h，将2mL发酵液用注射器喷入8mL预冷至-80℃的冷甲醇中，5000转离心2min，移除上清液，保存菌体于液氮中备用。本专利技术菌体破碎方式采用以下步骤。1）冷甲醇提取取100mg湿菌体于离心管中，加入2mL预冷至-40℃的冷甲醇（60%），85混匀后在漩涡振荡器中震荡1min，然后5000转离心4min（-4℃）。上述操作完成后将上清液转移至另一离心管中，并于-80℃条件保存。2）冷甲醇反复冻融取100mg湿菌体于离心管中，加入2mL预冷至-40℃的冷甲醇（60%），于液氮中冷冻2min，再在4℃条件下放置5min，如此反复冻融5次。然后5000转离心4min（-4℃），转移上清于另一离心管中保存在-80℃冰箱。3）液氮研磨将湿菌体放置在预冷至-80℃的研钵中，在液氮中研磨5min成乳白色细粉。取100mg研磨的乳白色细粉于离心管中，加入2mL预冷的甲醇水溶液（-40℃）。原始LC-MS数据通过Xcalibur2.0.5转化成NetCDF格式以后，用在线XCMS软件进行滞留时间校正、峰匹配和峰解析。对信噪比S/N小于10的峰排除，不予进行下一步的分析。对于代谢物种类的推定，则根据它们的MS/MS离子碎片从各数据库中检测所的到。根据样品LC-MS/MS检测的母离子及其ESI离子轰击碎片结合质谱数据库检索进行定性。将离子碎片及其相对丰度输入METLIN质谱数据检索框中可得到具有相似结构的代谢物离子碎片图，然后进行比对。在20V电压轰击下，主要离子碎片有97.0,101.0和125.0，与数据库中物质进行比对，推定该物质为四氢嘧啶（ectoine）。细胞内的代谢物库会随着细胞周围环境的变化迅速的改变。在代谢组学研究过程中，如何快速有效的淬灭细胞，并将细胞胞内代谢物库的组成停格在细胞特定的状态，是代谢组学研究的关键之一。鉴于以往并没有关于刺糖多孢菌代谢组学的研究，对比了两种代谢组学研究常用的细胞灭活方法，冷甲醇淬灭和快速离心的方法。将两种灭活方式检测到的代谢物及其相应的信号强度进行比较。以上内容是结合具体的优选实施方式对本专利技术作的进一步详细说明，不能认定本专利技术的具体实施只局限于这些说明，对于本专利技术所属
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本专利技术所提交的权利要求书确定的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多孢菌的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）将琼脂、葡萄糖、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、MgSO4·7H2O灭菌20min；2）将葡萄糖、MgSO4·7H2O、N‑Z‑AmineA、牛肉膏、酵母粉、灭菌20min。3）将葡萄糖、玉米浆、MgSO4·7H2O、棉籽蛋白、蛋白胨、麦芽糖、CaCO3灭菌20min；4）使用三角瓶，培养2天作为发酵所用的种子；5）发酵培养使用三角瓶，每瓶装发酵培养基接种子培养液，培养至对数期。

【技术特征摘要】
1.一种多孢菌的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）将琼脂、葡萄糖、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、MgSO4·7H2O灭菌20min；2）将葡萄糖、MgSO4·7H2O、N-Z-AmineA、牛肉膏、酵母粉、灭菌20min。3）将葡萄糖、玉米浆、MgSO4·7H2O、棉籽蛋白、蛋白胨、麦芽糖、CaCO3灭菌20min；4）使用三角瓶，培养2天作为发酵所用的种子；5）发酵培养使用三角瓶，每瓶装发酵培养基接种子培养液，培养至对数期。2.根据权利要求1所述一种多孢菌的制备方法，其特征在于所述琼脂，2g/L；葡萄糖，10g/L；酵母粉，3g/L；牛肉膏，1g/L；蛋白胨10g/L；MgSO4·7H2O，2g/L；N-Z-AmineA，30g/L；牛肉膏，2g/L；玉米浆，15g...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘铮，
申请(专利权)人：刘铮，
类型：发明
国别省市：辽宁;21