本发明专利技术提供鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单抗可变区基因，ZCH-2B8a单克隆抗体所识别的抗原是一个早期稳定的T细胞活化分子。以该抗体为基础制备的异硫氰酸荧光素（FITC）标记的2B8a-FITC荧光抗体对于抗原的结合具有高度的敏感性和特异性，同时活性良好，能识别经植物血凝素（PHA）刺激的活化T细胞和再生障碍性贫血等免疫相关性疾病病人外周血中的活化T细胞。因此，该荧光抗体可用于T细胞功能评估的基础研究和临床病例活化T细胞及其亚群的检测，可在制备靶向治疗活化T细胞介导的免疫相关性疾病药物中的应用。
【技术实现步骤摘要】
鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单抗可变区基因及用途
本专利技术属生物技术，主要涉及鼠抗人活化T细胞新抗原ZCH-2B8a (简称2B8a)单克隆抗体(单抗)可变区基因的克隆、测序及其在再生障碍性贫血等免疫相关疾病诊治中的用途。
技术介绍
机体免疫系统有免疫防御、免疫监视和免疫自稳的功能，T细胞在上述过程中起着举足轻重的作用。T细胞根据其分化状态和功能可分为初始、效应和记忆T细胞。初始T细胞必须先经过活化转变为效应T细胞才能在免疫应答中发挥作用。T细胞活化的正向和负向调控的平衡对免疫系统的稳定至关重要，任何一方的绝对优势都将引起疾病的发生。如T细胞在再次免疫应该过程中反应过强可以出现超敏反应引起组织损伤；体内存在针对自身抗原的自身反应性T细胞可以导致多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病；抑制性T细胞的功能过亢、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肿瘤抗原不能识别或T细胞信 号转导的缺陷可以导致肿瘤的发生；T细胞对同种异型抗原的识别是发生移植物抗宿主病(GVHD)的基础[1]。因此，T细胞的稳态是维持机体健康的基础，对于诸多免疫相关性疾病，纠正T细胞失衡的状态则有望治愈疾病。例如，在类风湿性关节炎、炎症性肠病、GVHD等病灶部位都可以发现0X40 + T细胞及0X40L+细胞的浸润[2]。因此，靶向0X40可能可以减少自身抗原反应性的T细胞，对上述疾病具有潜在的治疗价值。0X40靶向治疗主要是采用0X40L抗体或0X40Ig阻滞0X40-0X401 ]，也有采用0X40耦联免疫毒素清除0X40 + T细胞[4]，均在实验性自身免疫性脑脊髓炎等动物模型中取得了一定的疗效。利用单克隆抗体及其免疫毒素靶向杀伤活化T细胞以治疗免疫相关性疾病的理念已在临床研究中广泛开展。目前在进行I期和II期临床试验的就包括抗⑶3、⑶5、⑶7及IL-2R的单抗及其免疫毒素，针对T细胞活化分子VLA-4、CD40L、0X40等的单抗在临床前研究中也显示了良好的应用前景[5]。在儿童血液系统疾病中，再生障碍性贫血(AA)、噬血细胞综合征(HLH)等疾病的发生均与T细胞的过度活化、免疫失调密切相关。在AA，免疫抑制剂的治疗效果已非常肯定，可以使70%的患儿得到基本治愈[6]。但一般治疗过程需要数年，药物的毒副作用也非常大，况且仍有30%左右的病人治疗反应不佳。而HLH则是由于自身的免疫缺陷致病原体难以清除，导致T细胞过度活化和细胞因子风暴而损伤脏器，该病进展迅速、死亡率非常高，基本的治疗手段也是通过激素、环孢素及依托泊苷等药物抑制或杀灭T细胞而使疾病缓解[7]。我们在研究中也发现，上述病人的外周血T细胞表面T细胞活化分子呈高表达，这也为利用靶向活化分子杀伤活化的T细胞提供了理论基础。ZCH(Zhejiang Children’s Hospital)_2B8a (简称 2B8a)是鼠抗人造血细胞分化抗原的单克隆杂交瘤细胞株，以分化早期的CD34+白血病细胞KGla作为免疫原，采用经典杂交瘤技术制备而成。经三次亚克隆培养，建立了能稳定分泌2B8a抗体的杂交瘤细胞系。该抗体经递交第8届国际人类白细胞分化抗原协作组会议(8th International Workshopand Conference on Human Differentiation Antigens, HLDA8)鉴定后认为该抗体识别的抗原性质不明，属国际上尚未认识的造血细胞膜新的分化抗原或新的CD分子。研究表明，该抗体与正常外周血静止期T细胞不反应，但与活化的T细胞反应强烈，可能识别新的活化T细胞分子。因此，2B8a抗体具有开发成为靶向杀伤活化T细胞的大分子药物的临床应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鼠抗人活化T细胞抗原(ZCH-6_2B8a单抗，简称2B8a单抗)单抗的重链和轻链可变区基因，该单抗的重链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID NO I所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示；该单抗的轻链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。本专利技术的另一个目的是提供一种鼠抗人活化T细胞抗原(ZCH-6_2B8a单抗，简称2B8a单抗)单抗的重链和轻链可变区基因在制备靶向治疗活化T细胞介导的免疫相关性疾病药物中的应用，所述的免疫相关性疾病包括再生障碍性贫血、噬血细胞综合征、类风湿性关节炎等疾病。用于制备药物的是如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的重链可变区及如SEQ ID N04所示的氨基酸序列的轻链可变区的免疫球蛋白。研究表明，2B8a单抗能够有效识别人体内的活化T细胞，对于再生障碍性贫血、类风湿性关节炎、噬血细胞综合征等由T细胞过度活化介导发病的免疫性疾病具有靶向治疗的应用前景。采用单克隆抗体及其免疫制剂(如免疫毒素)靶向杀伤活化T细胞以期达到治疗免疫相关疾病的基本条件包括以下几方面:1.该抗体的反应谱窄，在人体的其他组织器官表面不表达或极低表达，以免在治疗过程中造成“脱靶效应”，对正常的组织器官产生毒副作用。2.该抗体识别的抗原在活化T细胞表面稳定表达。3.该抗体可以介导补体依赖的细胞毒作用(CDC)或抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC);或者当抗体偶联化学制剂如免疫毒素或放射性物质时，该抗体可有效介导内化。本研究组采用免疫组化技术观察了 2B8a单抗与人体组织芯片的反应情况。结果表明，2B8a抗原仅在扁桃体、淋巴结、胸腺、脾脏和骨髓等含淋巴系统的组织中表达，而在大脑、小脑、垂体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、唾液腺、咽部、食道、胃、小肠、大肠、直肠、肺、心脏、肝脏、胰腺、肾脏、膀胱、前列腺、子宫内膜、宫颈、乳腺、卵巢、睾丸、皮肤、骨骼肌等20余种脏器中均不表达。2B8a抗体在T细胞受PHA (植物凝集素)刺激后12h内即可表达于胞膜上，后表达强度逐渐增强，并于72 96h达高峰，之后仍呈持续高表达，提示它是一个早期稳定的T细胞活化分子。在再生障碍性贫血(AA)等免疫相关性疾病病人的血液标本的T细胞表面，2B8a抗原的表达明显上调，提示该抗体可能可用于AA等活化T细胞介导的疾病的治疗。此外，2B8a抗体可以快速内化进入细胞内，在4°C和37°C均可以快速“内化”。2B8a抗体能激活补体，介导补体依赖的 细胞毒作用杀伤Raji细胞，而对2B8a抗原阴性的细胞基本无杀伤作用。以上研究表明，2B8a抗体与血液淋巴组织之外的组织器官不存在交叉反应、与PHA刺激的活化T细胞及再障等免疫相关疾病的外周血T细胞具有良好的反应性，并且可以介导快速内化和免疫杀伤，具有治疗再障、噬血细胞综合症等活化T细胞介导的免疫相关性疾病的潜在应用价值。目前，鼠源性单克隆抗体、人鼠嵌合抗体和完全的人源化抗体在临床上具有应用价值。2012年的销售额最高的10大生物药品中单克隆抗体制剂占据了 6席，其中前三位都是治疗自身免疫性疾病类风湿性关节炎的，年销售额均在80亿美元以上[8]。但是该类药物价格昂贵，而国内尚未见治疗活化T细胞介导的免疫相关疾病的生物制剂的开发的报道。因此，针对免疫相关性疾病的单克隆靶向药物的开发具有开阔的临床应用前景和良好的社会和经济效益，将极大地降低有关疾病的治疗成本。附本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鼠抗人T细胞抗原ZCH?2B8a单克隆抗体可变区基因，其重链可变区基因的核苷酸序列为SEQ?ID?NO?1，编码的氨基酸序列为SEQ?ID?NO?3，其轻链可变区基因的核苷酸序列为SEQ?ID?NO?2，编码的氨基酸序列为SEQ?ID?NO4。
【技术特征摘要】
1.一种鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单克隆抗体可变区基因，其重链可变区基因的核苷酸序列为SEQ ID NO 1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO 3，其轻链可变区基因的核苷酸序列为SEQ ID NO 2，编码的氨基酸序列为SEQ ID N04。2.根据权利要求1所述的一种鼠抗人T细胞抗原ZCH...
【专利技术属性】
技术研发人员：汤永民，徐晓军，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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