本发明专利技术涉及一种癌抗原CA15-3的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法，试剂盒包括含有荧光素标记的癌抗原CA15-3抗体的溶液、包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液，以及含有碱性磷酸酶标记的癌抗原CA15-3抗体的溶液，该碱性磷酸酶标记的癌抗原CA15-3抗体由碱性磷酸酶与癌抗原CA15-3抗体通过交联剂SMCC和2-IT连接构成。本发明专利技术使得能够以更低成本和更高准确度和精密度对癌抗原CA15-3进行定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种结合了免疫磁微粒分离技术和化学发光免疫分析技术的癌抗原CA15-3的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法。
技术介绍
癌抗原CA15-3(Carbohydrate Antigen 15-3, CA15-3)是一种多形态上皮糖蛋白，分子量约为400kD，分子结构尚不完全清楚。CA15-3是1984年由Hilkens等从人乳脂肪球膜上糖蛋白MAM-6制成的单克隆抗体(115-DB),与此同时Kufu等自肝转移乳腺癌细胞膜制成单克隆抗体(DF-3)，两者合起来故被命名CA15-3。CA15-3主要用于乳腺癌的监测和筛选，以及用于评价患者预后情况的指标。乳腺癌患者30-50%CA15-3含量增高，有转移灶者增高可达80% ;发现癌转移的敏感性比癌胚抗原和组织多肽抗原高，且早于临床发现转移；CA15-3是监测病人术后复发情况，特别是癌症转移患者的术后监测的重要指标，血清CA15-3水平增高，提示乳腺癌的局部或全身复发，且增高早于核素检查和临床检查；用于对治疗的随查评估及早期发现转移灶，CA15-3的增高比临床诊断出转移灶要早几个月时间；CA15-3可与CA125联合检查，用于卵巢癌复发的早期诊断；与CEA联合检测时，可提高乳腺癌早期诊断的敏感性和特异性；其他恶性肿瘤，如肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌等，也可出现血清CA15-3增高。非恶性肿瘤疾病，如良性乳腺疾病、卵巢疾病等可引起CA15-3的水平增高。目前用于检测CA15-3的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。酶联免疫分析法存在灵敏度低，线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。化学发光免疫分析法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其具有上述诸多优点得到了广泛的应用。然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。中国专利技术专利公开CN102288766A公开了一种了糖类抗原15_3(CA15_3)的定量检测试剂盒，该试剂盒包括含有标记有抗CA15-3单克隆抗体的磁性微球的CA15-3磁分离试齐U，含有碱性磷酸酶标记的抗CA15-3单克隆抗体的酶反应物，反应增强液，稀释液，CA 15-3标准品，CA15-3质控品，清洗浓缩液以及底物溶液。该试剂盒虽然能够实现快速、准确地检测，但是其中，含有标记有抗CA15-3单克隆抗体的磁性微球的CA15-3磁分离试剂和含有碱性磷酸酶标记的抗CA15-3单克隆抗体的酶反应物的制备过程非常繁琐，工艺稳定性不好，且标记率低，限制其检测效果特别是精密度和导致成本增加。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种癌抗原CA15-3的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其能够以较低的成本制备得到，且能够实现癌抗原CA15-3准确和高精确地定量测定。本专利技术同时还提供一种癌抗原CA15-3的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，该方法工艺稳定，成本低，且所得试剂盒的精密度高。癌抗原所用的试剂盒的简便和低成本的制备方法。一种癌抗原CA15-3的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括 第一试剂含突光素标记的癌抗原CA15-3抗体的溶液；第二试剂含碱性磷酸酶(ALP)标记的癌抗原CA15-3抗体的溶液；磁分离剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液；其中，该碱性磷酸酶标记的癌抗原CA15-3抗体由碱性磷酸酶与癌抗原CA15-3抗体通过交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烧-1-羧酸琥拍酰亚胺酯(Succinimidyl4-(N-Maleimidomethyl)Cyclohexane-l-Carbo, SMCC)和 2_ 亚氨基硫烧盐酸盐(2-1minothiolane HCl, 2-1T)连接构成。进一步地，所述磁微粒试剂中，包被有荧光素抗体的磁微粒由荧光素抗体与磁微粒通过偶联剂相化学偶联。进一步地，所述第一试剂中的荧光素标记的癌抗原CA15-3抗体的浓度为O. 5 lyg/mL，所述第一试剂的pH为7-9 ;所述第二试剂中的碱性磷酸酶标记的癌抗原CA 15-3抗体的浓度为O. 5^1 μ g/mL，所述第二试剂的pH为7_9。本领域技术人员应知晓，本专利技术的试剂盒还可以进一步包括有其它检测所需的试齐U，例如底物溶液。但是诸如底物溶液等其它试剂可以另行购买或配制，因此，虽然试剂盒中可以包括这些试剂，但它们对于本专利技术试剂盒来说并非必不可少。本专利技术采取的又一技术方案是一种癌抗原CA15-3的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述第一试剂、所述第二试剂以及磁分离剂的步骤，其中所述第二试剂的制备过程如下①将癌抗原CA15-3抗体加入交联剂2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液中室温静置后，再加入甘氨酸溶液，再次室温静置，收集活化后的癌抗原CA15-3抗体，于2l°C下保存备用； ②将碱性磷酸酶溶液加入交联剂4- (N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液，室温静置，收集活化后的碱性磷酸酶，于疒8°C下保存备用；③将上述步骤①所得活化后的癌抗原CA15-3抗体与步骤②所得活化后的碱性磷酸酶混合，静置反应，使生成碱性磷酸酶标记的癌抗原CA15-3抗体，反应结束后，将反应液用Supperdex200凝胶纯化柱纯化,选择具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH值即得所述第二试剂；其中，所述的癌抗原CA15-3抗体、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg。优选地，步骤①中，取癌抗原CA15-3抗体，加入偶联剂2_IT溶液溶解，室温静置10mirT30min，加入甘氨酸溶液，室温静置2 10min，用G-25凝胶纯化柱除盐，收集活化后的癌抗原CA15-3抗体，于2-8°C保存备用。优选地，步骤②中，取浓度大于等于5mg/mL的碱性磷酸酶溶液，加入用SMCC溶液，室温静置2(T40min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，于2_8°C保存备用。优选地，步骤③中，将上述活化的癌抗原CA15-3抗体与活化的碱性磷酸酶按分子摩尔比为1:1 I 2混合，于2-8°C条件下静置12-24h。其中适当pH值的缓冲液可以为例如含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS缓冲液。进一步地，所述的第一试剂的制备方法如下配制含有荧光素的pH为扩10的缓冲液，然后按照荧光素与癌抗原CA15-3抗体的分子比为2(Γ200:1的比例,将所述含有荧光素的PH为9 10的缓冲液与癌抗原CA15-3抗体的pH为9 10的缓冲液混合，混匀后，室温静置反应，然后将反应液本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种癌抗原CA15?3的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括：第一试剂：含荧光素标记的癌抗原CA15?3抗体的溶液；第二试剂：含碱性磷酸酶标记的癌抗原CA15?3抗体的溶液；磁分离剂：含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液；其中，该碱性磷酸酶标记的癌抗原CA15?3抗体由碱性磷酸酶与癌抗原CA15?3抗体通过交联剂4?(N?马来酰亚胺基甲基)环己烷?1?羧酸琥珀酰亚胺酯和2?亚氨基硫烷盐酸盐连接构成。
【技术特征摘要】
1.一种癌抗原CA15-3的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括第一试剂含突光素标记的癌抗原CA15-3抗体的溶液；第二试剂含碱性磷酸酶标记的癌抗原CA15-3抗体的溶液；磁分离剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液；其中，该碱性磷酸酶标记的癌抗原CA15-3抗体由碱性磷酸酶与癌抗原CA15-3抗体通过交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和2-亚氨基硫烷盐酸盐连接构成。2.根据权利要求1所述的癌抗原CA15-3的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于所述磁分离试剂中，荧光素抗体与磁微粒之间相化学偶联。3.根据权利要求1或2所述的癌抗原CA15-3的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于所述第一试剂中的荧光素标记的癌抗原CA15-3抗体的浓度为O. 5^1 μ g/mL，所述第一试剂的pH为7-9 ;所述第二试剂中的碱性磷酸酶标记的癌抗原CA15-3抗体的浓度为O.5^1 μ g/mL，所述第二试剂的pH为7-9。4.一种如权利要求3所述的癌抗原CA15-3的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述含有荧光素标记的癌抗原抗体的溶液、所述含有碱性磷酸酶标记的癌抗原CA15-3抗体的溶液以及所述包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液的步骤，其特征在于所述含有碱性磷酸酶标记的癌抗原CA15-3抗体的溶液的制备过程如下①将癌抗原CA15-3抗体加入交联剂2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液中室温静置后，再加入甘氨酸溶液，再次室温静置，收集活化后的癌抗原CA15-3抗体，于2l°C下保存备用；②将碱性磷酸酶溶液加入交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液，室温静置，收集活化后的碱性磷酸酶，于2l°C下保存备用；③将上述步骤①所得活化后的癌抗原CA15-3抗体与步骤②所得活化后的碱性磷酸酶混合，静置反应，使生成碱性磷酸酶标记的癌抗原CA15-3抗体，反应结束后，将反应液用Supperdex200凝胶纯化柱纯化,选择具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH值即得所述第二试剂；其中，所述的癌抗原CA15-3抗体、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤①中，取癌抗原CA15-3抗体，加入偶联剂2-1T溶液溶解，室温...
【专利技术属性】
技术研发人员：于大为，程晓蕾，赵文姬，
申请(专利权)人：苏州浩欧博生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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