利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法制造技术

本发明专利技术一种利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELI?SA法，通过蛋白纯化技术将原核表达C-Myc蛋白提纯；进行免疫的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法筛选，亚克隆及单克隆抗体Ig亚型鉴定，获得2株能够稳定分泌抗C-myc?IgG1的克隆及抗C-myc?IgM克隆。利用抗c-Myc?IgG1抗体以及抗c-Myc?IgM抗体，建立快速检测c-Myc的一种夹心法ELISA法和两种直接法ELISA法。本发明专利技术对C-myc蛋白样品进行准确测定，可检测的C-myc蛋白浓度范围为0.01～1000pmol/L，检出下限为0.01～0.05pmol/L，大大提高了检测C-Myc的特异性和敏感性，操作简单、重复性高，本发明专利技术检测肿瘤组织中的C-Myc的表达量，为恶性肿瘤的筛选提供实验数据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种肿瘤检测试剂盒开发领域，更具体地说，涉及一种利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法。
技术介绍
原癌基因C-myc是一种使细胞无限增殖、获永生化功能、促进细胞分裂的可调节基因，在很多肿瘤中都高表达[1]。在癌变细胞中，C-myc蛋白表达异常增高，使细胞脱离正常生长的调节限制，向恶性表型转化，发生癌变。据报道，C-myc基因的过表达与肿瘤发生发展密切相关，如白血病，肺癌，肝癌，胃癌，乳腺癌，结肠癌，宫颈癌，某些神经母细胞病，视网膜母细胞瘤，成骨肉瘤，软骨肉瘤，脊索瘤，脂肪肉瘤，横纹肌肉瘤，何杰金氏病及头部肿瘤等都有C-myc基因的扩增或过度表达[2]。特别是在所有的B淋巴细胞性白血病组织中C-myc基因过表达[3]。与正常细胞相比，肿瘤细胞中C-myc的表达量增高几十倍，是恶性肿瘤发生的一个重要标志。目前，有关C-Myc研究的文章及专利如下(I)Dang CV, Resar LM, Emi son E, et al. Function of the C-myconcogenictranscription factor[J]. Exp Cell Res, 1999, 253(1):63-77.(2) Riou GF, Bourhis J, Le MG. The C-myc proto-oncogene in invasivecarcinomasof the uterine cervix:clinical relevance of over expression in earlystages of thecancer[J]. Anticancer Res, 1990, 9-10(5A):1225-1231.(3) May PC, Foot N, Dunn R, et al. Detection of cryptic and variantIgH-MYCrearrangements in high-grade non-Hodgkin's lymphoma by fluorescencein situhybridization:1mplications for cytogenetic testing[J]. Cancer GenetCytogenet, 2010, 198(1) : 71-75.(4)用于检测致癌基因C-myc重组蛋白的LSPR传感芯片(专利公开号CN102175649A)(5)—种致癌基因C-myc蛋白的荧光光谱测定方法(专利公开号CN101893573A)文章1-3主要研究关于C-Myc在肿瘤组织中的高表达的意义以及其机理。专利4专利技术提供了一种基于局域表面等离子体共振(LSPR)光谱检测致癌基因C-myc重组蛋白的LSPR传感芯片。在LSPR传感芯片的金膜表面组装上一层DTT单分子层，接上金纳米粒子层，在所述金纳米粒子层表面修饰上3-巯基丙酸单分子层，然后通过DMAP-EDC活化,使3-巯基丙酸单分子层与C-myc单克隆抗体结合,通过C_myc单克隆抗体与C-myc重组蛋白的免疫反应结合，引起金纳米粒子表面产生局域表面等离子体共振吸收峰的位移，以此来检测癌变组织中C-myc重组蛋白的含量。专利5专利技术公开了一种致癌基因C-myc蛋白的荧光光谱测定方法，其测定依据是C-myc蛋白本身具有荧光性并且与金纳米溶胶结合后发生荧光猝灭现象，该荧光猝灭强度(AF)与C-myc蛋白浓度变化之间呈线性对应关系,达到测定C_myc蛋白含量的目的。目前,利用两种单克隆抗体快速检测c-Myc的ELISA尚无报道。
技术实现思路
本专利技术开发一种利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA，旨在获得稳定分泌特异性和敏感性很高的抗C-myc IgG1单克隆抗体和IgM单克隆抗体，为多种肿瘤特别是B淋巴细胞性白血病诊断试剂盒的开发提供坚实的数据基础。为了达到上述目的，本专利技术一种利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，包括如下步骤S1、制备C-myc抗原,并纯化,获得纯化的C_myc蛋白；S2、利用所述纯化的C-myc蛋白进行免疫健康Balb/c小鼠；S3、将免疫Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合；S4、筛选阳性杂交瘤细胞；S5、对所述阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，获得2株能够稳定分泌抗C-myc IgG1的克隆及抗C-myc IgM的单克隆抗体杂交瘤细胞株；S6、Balb/c小鼠腹腔内注射两种所述单克隆抗体杂交瘤细胞株，大量制备单克隆抗体；S7、选用以下三种方法中的任意一种，实现快速检测C-Myc 方法1:利用两种抗c-Myc单克隆抗体检测肿瘤细胞c_Myc表达量的夹心法ELISA法。方法2 :利用抗c-Myc IgM单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的直接法ELISA法。方法3:利用抗c-Myc IgG单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的直接法ELISA法。优选方式下，步骤SI的具体分步为S11、将含有原核表达载体的pET20b-C-myc表达菌E. coli BL21在37°C震荡培养，170rpm ；S12、经IPTG诱导后，收集菌体，超声波打碎、利用镍柱子层析纯化。具体说，步骤SI的具体方法为将含有原核表达载体pET20b-C-myc表达菌的E.coli BL21 在 37°C震荡培养，170rpm;菌液 OD6tltol 值为 0.4-0.6时，经1-2禮 IPTG 诱导1-3小时后，6500rmp离心IOmin收集细胞，悬浮，破碎超声破碎仪破碎细胞10min，2_8M尿素进行变性2h后再复性，经AKATA仪用镍离子亲和层析柱纯化蛋白，最后得到90-95%以上纯度的C-Myc蛋白。优选方式下，上述步骤S2具体步骤为利用原核表达并纯化的C-myc蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，将抗原注射入健康Balb/c小鼠腹腔内，0. 4ml/只，抗原量为50-lOOy g/只；首次免疫14天后，改用弗氏不完全佐剂与同体积的抗原量充分乳化进行第2次免疫，抗原量不变；第28天，按照100-200 u g/只抗原量对小鼠进行第三次免疫，小鼠的抗体效价达到了1:64000-1 1280000。优选方式下，上述步骤S3具体步骤为Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以5:1-10:1的比例混合于50ml离心管中，1200rpm、5min离心，弃上清,在25s_30s内迅速滴A 37°C预热的50%的PEG1000约0. 5ml并轻轻混匀，700rpm、2min离心，再沿管壁缓慢加入37°C预热的RPM1-1640基础培养基15ml，使试管做划圆样运动约2min，离心1400rpm、5min，弃上清，同法再清洗I次。沿管壁缓慢加入37°C预热的HT培养基30ml，轻轻混匀融合细胞。优选方式下，上述步骤S5具体步骤为当杂交瘤细胞集落生长40-60%以上时，用ELISA方法筛选阳性孔；针对阳性孔，用HT培养基稀释细胞，进行亚克隆。培养第8-9天，对标记的单克隆细胞孔的上清进行ELISA检测，筛选阳性克隆。优选方式下，上述步骤S6具体步骤为向健康雌性Balb/c小鼠腹腔内注射高压灭菌后的液体石腊油，0. 4-0. 6ml/只。一周后,再向其腹腔注射能稳定分泌C-my本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用单克隆抗体快速检测C?Myc的ELISA法，其特征在于，包括如下步骤：S1、制备C?myc抗原，并纯化，获得纯化的C?myc蛋白；S2、利用所述纯化的C?myc蛋白进行免疫健康Balb/c小鼠；S3、将免疫Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合；S4、筛选阳性杂交瘤细胞；S5、对所述阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，获得2株能够稳定分泌抗C?myc?IgG1的克隆及抗C?myc?IgM的单克隆抗体杂交瘤细胞株；S6、Balb/c小鼠腹腔内注射两种所述单克隆抗体杂交瘤细胞株，大量制备单克隆抗体；S7、选用以下三种方法中的任意一种，实现快速检测C?Myc：方法1：利用两种抗c?Myc单克隆抗体检测肿瘤细胞c?Myc表达量的夹心法ELISA法。方法2：利用抗c?Myc?IgM单克隆抗体检测肿瘤细胞c?Myc表达量的直接法ELISA法。方法3：利用抗c?Myc?IgG单克隆抗体检测肿瘤细胞c?Myc表达量的直接法ELISA法。

【技术特征摘要】
1.一种利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，包括如下步骤 51、制备C-myc抗原,并纯化,获得纯化的C-myc蛋白； 52、利用所述纯化的C-myc蛋白进行免疫健康Balb/c小鼠； 53、将免疫Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合； 54、筛选阳性杂交瘤细胞； 55、对所述阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，获得2株能够稳定分泌抗C-mycIgG1的克隆及抗C-myc IgM的单克隆抗体杂交瘤细胞株； 56、Balb/c小鼠腹腔内注射两种所述单克隆抗体杂交瘤细胞株，大量制备单克隆抗体； 57、选用以下三种方法中的任意一种,实现快速检测C-Myc 方法1:利用两种抗C-Myc单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的夹心法ELISA法。方法2 :利用抗c-Myc IgM单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的直接法ELISA法。方法3 :利用抗c-Myc IgG单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的直接法ELISA法。2.根据权利要求1所述利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，步骤SI的具体方法为 511、将含有原核表达载体的pET20b-C-myc表达菌E.coli BL21在37°C震荡培养，170rpm ； 512、经IPTG诱导后，收集菌体，超声波打碎、利用镍柱子层析纯化。3.根据权利要求2所述利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，SI的具体方法为将含有原核表达载体pET20b-C-myc表达菌的E. coliBL21在37°C震荡培养，170rpm ;菌液 OD6ticinm 值为 0. 4-0. 6 时，经 l_2mM IPTG 诱导 1-3 小时后，6500rmp 离心 IOmin收集细胞，悬浮，破碎超声破碎仪破碎细胞lOmin，2-8M尿素进行变性2h后再复性，经AKATA仪用镍离子亲和层析柱纯化蛋白，最后得到90-95%以上纯度的C-Myc蛋白。4.根据权利要求3所述利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，S2具体步骤为利用原核表达并纯化的C-myc蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，将抗原注射入健康Balb/c小鼠腹腔内，0. 4ml/只，抗原量为50-100 y g/只；首次免疫14天后，改用弗氏不完全佐剂与同体积的抗原量充分乳化进行第2次免疫，抗原量不变；第28天，按照100-200 yg/只抗原量对小鼠进行第三次免疫，小鼠的抗体效价达到了1:64000-1 1280000。5.根据权利要求4所述利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，S3具体步骤为Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以5:1-10:1的比例混合于50ml离心管中，1200rpm、5min离心，弃上清，在25s_30s内迅速滴入37°C预热的50%的PEG1000约0. 5ml并轻轻混匀，700rpm、2min离心，再沿管壁缓慢加入37°C预热的RPM1-1640基础培养基15ml,使试管做划圆样运动约2min,离心1400rpm、5min,弃上清，同法再清洗I次。沿管壁缓慢加入37°C预热的HT培养基30ml，轻轻混匀融合细胞。6.根据权利要求5所述利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，S5具体步骤为当杂交瘤细胞集落生长40-60%以上时，用ELISA方法筛选阳性孔； 针对阳性孔，用HT培养基稀释细胞，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文哲，金锦花，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
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