癌胚抗原检测试剂盒及其制备制造技术

本发明专利技术提供一种癌胚抗原检测试剂盒，所述试剂盒基于胶体金免疫比浊法，包括试剂R2，所述试剂R2为含有标记了癌胚抗原抗体的金纳米颗粒的溶液，其特征在于，所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm-79.1nm，所述金纳米颗粒和抗体质量比为50：20–60。还本发明专利技术还提供该试剂盒的制备方法。本发明专利技术试剂盒具有灵敏度高，特异性强，反应迅速，稳定性好的特点，反应后不产生沉淀，便于生化仪的清洗，延长了生化仪的使用寿命。

【技术实现步骤摘要】
癌胚抗原检测试剂盒及其制备
[0001 ] 本申请涉及一种基于胶体金免疫比浊法的癌胚抗原检测试剂盒及其制备。
技术介绍
癌胚抗原(CEA)是1965年Gold和Freedman首先从胎儿及结肠癌组织中发现的分子量为22KD的多糖蛋白复合物，45%为蛋白质，CEA的编码基因位于19号染色体，由胎儿胃肠道上皮组织、胰和肝的细胞所合成，在妊娠前6个月内CEA含量增高，出生后血清中含量已很低下。健康成年人血清中CEA浓度小于2.5yg/L，吸毒、吸烟严重者也可升高(康格非，巫向前.临床生物化学和生物化学检验.人民卫生出版社1998年10版)。癌胚抗原的常用检测有免疫比浊法和酶联免疫吸附法等。由于酶联免疫吸附法检测耗时且操作复杂，已经不能满足大型医院快速定量检测的要求，而免疫比浊法随着全自动生化仪的普及，已经发展出来多种快速免疫比浊检测技术。乳胶增强免疫透射比浊法的基本原理是，首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时，抗原抗体结合而出现乳胶凝集。单个乳胶颗粒的大小在入射波长之内，光线可透过，当两个以上的乳胶颗粒凝集时，可阻碍光线透过，使得透射光减少，其减少程度与抗原的量成正比。此法提高了检测的灵敏度和准确度，得到了广泛的应用。然而，乳胶增强免疫比浊法反应后会产生沉淀，不利于生化仪的清洗，干扰试验结果，且乳胶制造成本较高，导致免疫比浊试剂盒价格和检测成本偏高。因此又出现了纳米颗粒增强的免疫比浊法,如专利CN101680890便公开了一种通过比浊法测量人抑半肮氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定方法和试剂组合，以及中国专利CN101819208中公开了一种利用微球免疫比浊法检测脑钠肽试剂盒。专利CN101680890中具体公开了，表面修饰了抗体的由聚苯乙烯、聚氯乙烯、环氧树脂、聚偏1，1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙稀酸酯、聚乙烯萘以及它们相应的共聚物制成的粒径在80-105nm的有机高分子胶体纳米颗粒。本专利技术研究表明，许多纳米颗粒此范围之内并不满足试验的要求，比如:氧化铁等磁性纳米颗粒在40nm以上时由于顺磁性和比重等因素而容易聚沉无法达到应有的稳定性；金纳米颗粒在粒径80-150nm的范围内稳定性太差而不合适等。根据中国专利CN102749454的教导，本专利技术以直径为35nm_60nm的胶体金颗粒进行试验，发现，灵敏度较差，无法满足临床中对灵敏度小于Ing/mL的要求，和最低检测限5ng/mL的要求，且线性范围不覆盖临床中正常生理和病理情况的浓度区间，因此常常造成假阴性的结果；同时还存在反应时间长(平衡时间5-10min)，无法达到快速检验的要求。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的错误教导，解决现有技术中存在的上述缺陷，本专利技术提供一种基于胶体金免疫比浊法的癌胚抗原检测试剂盒。该试剂盒线性范围宽、灵敏度高，制造成本低，反应后不产生沉淀，方便生化仪清洗。根据本专利技术的一方面，提供一种基于胶体金免疫比浊法的癌胚抗原检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R2，所述试剂R2为含有标记了癌胚抗原抗体的金纳米颗粒的溶液，所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm-79.lnm,优选67.2nm-72.4nm ;所述金纳米颗粒和抗体质量比在 50:20 - 60，优选 50:40-60ο具体来讲，所述试剂R2为PH值5.0-9.5，优选6.0-8.5的溶液。进一步地，所述试剂R2还含有促凝剂、稳定剂、蔗糖和甘油，其中，促凝剂为重量体积比0.4%以内的PEG20000，稳定剂为重量体积比2%以内的BSA，蔗糖的重量体积比为20%以下，甘油的重量体积比为20%以下。作为优选，上述R2为含有粒径为72.4± 1.5nm且标记了癌胚抗原的金纳米颗粒、重量体积比20%蔗糖、重量体积比0.2% PEG20000、重量体积比0.5% BSA和重量体积比5%甘油的，pH7.2的磷酸盐缓冲液，其中，金纳米颗粒和抗体的重量比为50:40-60。更进一步地，所述基于胶体金免疫比浊法的癌胚抗原检测试剂盒还包括起缓冲和稳定作用的试剂Rl，所述试剂Rl为含有重量体积比0.2% BSA、重量体积比0.1%的NaN3和重量体积比0.05% Tween20的，pH7.2的磷酸盐缓冲液。在本专利技术的试剂盒中，专利技术点主要在试剂R2，试剂Rl也可以使用现有免疫比浊法中检测试剂盒的试剂R1。上述试剂R2通过如下方法制备:制备金纳米颗粒；将抗体偶联到金纳米颗粒，得偶联抗体的纳米金颗粒溶液；偶联抗体的纳米金颗粒溶液中加入稳定剂和促凝剂；2800rpm 离心 2 小时；离心沉淀用含重量体积比20%蔗糖、重量体积比0.2% PEG20000、重量体积比0.5% BSA和重量体积比5%甘油，pH值7.2的磷酸盐缓冲液重悬，调整浓度至OD54tlnm为0.2。抗体的活性容易受到蛋白酶的分解、高温变性、渗透压等影响，可加入稳定剂来稳定抗体的结构和活性。所述稳定剂可以是蛋白质、PEG、糖和可溶性的碱金属和碱土金属的无机盐中的一种或多种；其中，所述蛋白质优选牛血清白蛋白(BSA)或明胶；所述糖可以是单糖、二糖或者多糖，其中，单糖优选甘露糖、半乳糖和/或葡萄糖；二糖优选乳糖和/或蔗糖；多糖优选海藻糖、葡聚糖、甘露糖和葡萄糖中的一种或多种；所述无机盐优选齒素碱金属和碱土金属的无机盐，更优选氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或多种。本专利技术的试剂盒中，试剂R2还可以加入促凝剂，以增加抗原抗体反应速率。本专利技术所提供试剂盒中R2可以是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种缓冲液体系；优选磷酸盐缓冲液体系。本专利技术至少实现了如下有益效果:本专利技术试剂盒具有灵敏度高，特异性强，稳定性好的特点，反应时间短，显色反应时间小于30s，平衡时间小于2min，可用于检测血清或血浆中癌胚抗原含量，适用于临床全自动生化分析仪。本专利技术试剂盒检测癌胚抗原的灵敏度可以达到0.5ug/L，检测线性范围达0.0 ?500.0ug/Lo本专利技术试剂盒反应后不产生沉淀，便于生化仪的清洗，延长了生化仪的使用寿命。本专利技术的试剂盒采用胶体金标记抗体，降低了胶体金免疫比浊法的癌胚抗原检测试剂盒的制造成本，具有较大的市场竞争力。【附图说明】图1:本专利技术实施例1-7检测的标准曲线。图2:本专利技术实施例9-15检测的标准曲线。【具体实施方式】以下，将详细说明本专利技术的具体实施例，以便本领域技术人员能够更详细地理解本专利技术。金纳米颗粒以类似胶体状态存在，又称胶体金。本专利技术所提供基于胶体金免疫比浊法的癌胚抗原检测试剂盒中，试剂Rl可以使用现有技术中免疫比浊法检测试剂盒中的试剂R1，即已有的商用品。具体来讲，试剂Rl可以是含有0.2% BSA(w/v)作为稳定剂、0.1% NaN3 (w/v)作为防腐剂和0.05% Tween20 (w/V)作为促凝剂的，50mM的磷酸盐缓冲液(pH7.2),是一种促使抗原位点暴露促进抗原抗体反应的缓存液。以下各实施例仅制备试剂R2。实施例1本实施例试剂R2的制备分为三步，首先制备胶体金溶液，然后将抗体偶联到金纳米颗粒上，最后和缓冲盐、促凝剂和防腐剂等混溶成完整的体系。具体过程如下:I) 50nm的胶体金的制备按如下步骤:在清洗干净的IOOOml圆底烧本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种癌胚抗原检测试剂盒，所述试剂盒基于胶体金免疫比浊法，包括试剂R2，所述试剂R2为含有标记了癌胚抗原抗体的金纳米颗粒的溶液，其特征在于，所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm‑79.1nm，所述金纳米颗粒和抗体质量比为50：20–60。

【技术特征摘要】
1.一种癌胚抗原检测试剂盒，所述试剂盒基于胶体金免疫比浊法，包括试剂R2，所述试剂R2为含有标记了癌胚抗原抗体的金纳米颗粒的溶液，其特征在于，所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm-79.lnm，所述金纳米颗粒和抗体质量比为50:20 - 60。2.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述金纳米颗粒的粒径为67.2nm-72.4nm。3.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述金纳米颗粒和抗体质量比为50:40-60。4.权利要求2或3任意一项所述试剂盒，其特征在于，所述试剂R2为PH值5.0-9.5的溶液。5.权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂R2为PH值6.0-8.5的溶液。6.权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂R2还含有促凝剂、稳定剂、蔗糖和甘油，其中，所述稳定剂为蛋白质、PEG、糖和可溶性的碱金属和碱土金属的无机盐中的一种或多种；所述蛋白质为牛血清白蛋白或明胶；所述糖为单糖、二糖或者多糖；所述无机盐为卤素碱金属和碱土金属的无机盐；试剂R2为是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种的组合。7.权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述促凝剂为重量体积比0.4%以内的PE...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯淑霞，王万霞，
申请(专利权)人：北京玖佳宜科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11