具有导向治疗低毒副作用的癌胚抗原特异性结合肽制造技术

本发明专利技术涉及癌胚抗原阳性肿瘤的导向治疗研究，属于生物医学工程领域。通过噬菌体随机展示肽库筛选出与癌胚抗原特异性结合的结合肽，这些结合肽可以用作癌胚抗原阳性肿瘤导向治疗药物的载体；将该结合肽与TNF-α融合，表达产生的融合蛋白能特异结合癌胚抗原，并且对癌胚抗原阳性的LoVo细胞有细胞毒活性，表明该融合蛋白能用于癌胚抗原阳性肿瘤细胞的治疗。

【技术实现步骤摘要】
具有导向治疗低毒副作用的癌胚抗原特异性结合肽
本专利技术属于生物医药领域，具体的是涉及一种具有导向治疗低毒副作用的癌胚抗原特异性结合肽。
技术介绍
本专利技术公开了两种与癌胚抗原特异性结合的环七肽，及其与肿瘤坏死因子的融合蛋白，更具体地说，包括两条结合肽的氨基酸序列、核昔酸序列和融合蛋白的氨基酸序列、 核普酸序列以及构建的融合蛋白表达载体。癌胚抗原(carcinoembryonic antign，CEA)是一种肿瘤标志物和肿瘤相关性抗原，高表达于上皮源性的肿瘤组织，尤其是消化道肿瘤如结肠癌、直肠癌中。针对CEA的导向治疗主要集中于特异性结合CEA的抗体或单链抗体的研究，将单抗或单链抗体与细胞毒素如阿霉素、氨甲喋呤、肿瘤坏死因子等偶联，通过单抗的特异性结合作用使毒素能富集于肿瘤部位，提高靶部位的药浓度，从而达到导向治疗、降低毒副作用的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述抗癌药物研发现状，提供一种具有导向治疗低毒副作用的癌胚抗原特异性结合肽，从而克服单抗和单链抗体分子量大，穿透力弱，难以到达靶部位尤其是实体瘤组织的缺点。并且鼠源性的单抗应用于人体会产生人抗鼠抗体，而小肽则具有免疫原性低的优点。本专利技术的技术途径是从噬菌体展示肽库中筛选出CEA的特异性结合肚，将此结合肽与肿瘤坏死因子(TNF-α )融合表达，形成融合蛋白，以使结合肽的CEA结合活性与 TNF-α的细胞毒活性偶联，该融合蛋白为、能导向杀伤CEA阳性肿瘤。其特征为1)从噬菌体随机展示环七肽库中筛选出与CEA特异结合的环七肽。2 ) CEA结合肽的氨基酸序列为CPAPWGRLC。 3 )构建序列为CPAPWGRLC的结合肽CSP-I与TNF-α的融合蛋白CSP-I-TNF的表达载体，二者之间加入两个甘氨酸作为柔性接头。4 )构建序列为 CLRGffPAPC的结合肽CSP-2与TNF-α的融合蛋白CSP-2-TNF的表达载体，二者之间加入两个甘氨酸作为柔性接头。5 )表达并纯化CSP-I-TNF、CSP-2-TNF，检测表明上述二者均能与CEA特异性结合，并且能够竞争抑制筛选出的与CEA结合的单克隆噬菌体与CEA 的结合。6 ) CSP-I-TNF、CSP-2-TNF均有杀伤细胞的细胞毒活性，CSP-1-TNF具有对LoVo细胞的细胞毒活性。附图说明图1 CAE结合肽的氨基酸序列330-339为小肽的编号，氨基酸序列从左到右为 N端到C端；图2噬菌体单克隆与CEA亲和力比较； 图3噬菌体单克隆特异性的比较；3图4 CSP-I-TNF表达载体pBV220-CSP-l-TNF的构建图； 图5 CSP-2-TNF表达载体pBV220-CSP-2-TNF的构建图。具体实施方式实施例一CEA结合肽的筛选以CEA为靶蛋白从噬菌体随机展示环七肽库中筛选与CEA特异结合的结合肽，经过四轮的筛选，得到了一系列与CEA特异结合的噬菌体单克隆，从中随机挑取10个单克隆测序，其外源展示肽序列见图1。用ELISA的方法检测各个单克隆噬菌体的CEA结合力的大小及特异性(图2、 图3 )，确定结合力和特异性最好的的单克隆的外源展示肽的序列为PAPWGRL，因为是环肽库，所以结合肽应在两侧加上半肽氨酸，即CPAPffGRLC。实施例二 CSP-I-TNF表达载体的构建(图4 ) 1 .合成CSP-I的基因合成CSP-I基因的两互补片段，并在其基因的5 ’端加上两个甘氨酸的基因密码子， 基因两侧分别加上EcoR工的酶切位点。片段1 5 ’ AATTCACCACCGCACAGACGACCCCACGGAGCCGGGCACATG 3 ’ 片段2 5 ’ AATTCATGTGCCCGGCTCCGTGGGGTCGTCTGTGCGGTGGTG 3 ’将片段1和2等比例混勻，94 V水浴变性3min，待其慢慢冷却至室温，使两互补片段退火。酶切并连接PBV220-TNF 用 EcoR I 酶切，酶切体系为pBV220_TNF 质粒溶液 8. 5 μ 1，IOXH buffer 1μ 1, EcoR I 0.5μ 1, 37°C温育Ih，琼脂糖凝胶电泳鉴定，片段切下回收，与退火的CSP-I基因片段连接，连接体系为PBV220-TNF质粒酶切后回收的片段4μ1，退火后的目的基因片段6μ1，Ligation Solution I 10 μ 1,混勻，16°C连接Ih。鉴定连接产物转化大肠杆菌BL21 ( DE3 )感受态，挑单克隆培养，分别测序鉴定和表达鉴定，确定正确克隆。实施例三CSP-2-TNF表达载体的构建(图5 )将CSP-I的氨基酸序列颠倒，为CLRGffPAPC，记为CSP-2。以pBV220_TNF为模板， 通过两次PCR将CSP-2的基因逐步加入到TNF-α基因的上游。UPCR 反应第一次PCR 上游引物为5 ’ CGGCTCCGTGCGGTGGTGTCAGATCATCTTCTCGA 3 ’ ， 下游引物为5 ’ GGGTCATCACAGGGCAATGATC 3 ’，含 Sma I 酶切位点。PCR 参数为94°C，2 min;94°C，30 sec ；55°C,30 sec ；72°C, Imin，进行 5 个循环；94°C，30 SeC, 60°C, 1 min，72 °C，Imin，共 25 个循环；72°C，7 min。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，切下目的片段回收，与PMD18-T连接，转化后挑单克隆测序，从中选正确克隆的质粒作为模板进行第二次PCR。第二次PCR 上游引物为5 ’ GGAATTCATGTGCCTGCGTGGTTGGCCGGCTCCGTGCGGTGGT3 ’，含 EcoR I 酶切位点。下游引物为5，GGGTCATCACAGGGCAATGATC3，，PCR 参数为94°C，2 min ；94°C，30 sec ；55°C，30 sec ；72°C，lmin，进行 5 个循环； 94°C, 30 Sec ；60°C, 1 min ;72°C，Imin，共 25 个循环；72°C，7 min。产物用1 %琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，与pMD 18-T连接，转化大肠杆菌 BL21 ( DE3 )，挑单克隆测序，从中选择正确克隆。2、酶切及连接正确克隆用EcoR I，Sma I双酶切，酶切体系为EcoR I、Sma I各0.5 μ ，质粒溶液 7μ1，10ΧΤ buffer 1 μ 1, IOXBSA 1μ l,37°C,lh，同时将 pBV220 用 EcoR I、Sma I双酶切。酶切产物1 %琼脂糖凝胶电泳。回收目的片段，连接。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有导向治疗低毒副作用的癌胚抗原特异性结合肽，其特征在于其氨基酸序列从N 末端至丨J C末端为=C-P-A -P-W-G-R-L-C 。2.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜冲，
申请(专利权)人：大连创达技术交易市场有限公司，
类型：发明
国别省市：