多杀性巴氏杆菌无细胞抗原、制备方法及其应用技术

本发明专利技术关于一种多杀性巴氏杆菌无细胞抗原，其中所述抗原来自灭活的多杀性巴氏杆菌培养物的上清液，所述上清液含有多糖和蛋白。本发明专利技术还提供一种利用所述抗原建立的多杀性巴氏杆菌间接血凝试验方法，该方法具有良好的特异性和敏感性；本发明专利技术还提供一种含有所述抗原的疫苗。本发明专利技术的多杀性巴氏杆菌无细胞抗原疫苗具有与全菌疫苗同等的免疫效力，且具有不影响动物生长、疫苗注射部位局部副反应小的优点。

【技术实现步骤摘要】
多杀性巴氏杆菌无细胞抗原、制备方法及其应用
本专利技术涉及兽用生物制品领域，特别涉及一种多杀性巴氏杆菌无细胞抗原。
技术介绍
多杀性巴氏杆菌（Pasteurellmultoeida,Pm)能引起多种动物的巴氏杆菌病，如禽类的禽霍乱、猪肺疫、牛、兔等动物的出血性败血症。该类疾病分为急性、亚急性和慢性三类，前两种发病快、死亡率高，第三类容易导致动物生长迟缓、饲料转化率降低及继发感染其它细菌或病毒，继而造成巨大的经济损失。有效的疫苗接种是预防和控制该类疾病的有效途径，各种动物的巴氏杆菌灭活疫苗及弱毒疫苗为该病的防控做出了巨大的贡献。但目前所使用的疫苗多为全菌疫苗，虽然临床效果不错，但由于该菌属于革兰氏阴性菌，高浓度的菌液中不仅含有高浓度的抗原物质，而且含有高浓度的内毒素，因而使得该类疫苗在临床应用中的副反应较大，在注射部位容易形成硬结，而且其交叉保护性差，免疫持续期不长。弱毒活疫苗的交叉免疫效果较好，但接种后应激反应较强，并不能完全预防该病的发生。因此，人们想到了去除菌体，保留有效抗原成分制备成成分较为单一的疫苗。荚膜多糖是多杀性巴氏杆菌重要的组成部分，研究表明，荚膜多糖不仅与菌株的毒力有关，而且还是多杀性巴氏杆菌重要的保护性抗原。于是人们采用不同的方法提取多杀性巴氏杆菌的荚膜多糖制备成亚单位疫苗，早在上世纪80年代，NeylanA等在专利US005225194A中就对多杀性巴氏杆菌多糖疫苗的制备进行了详细描述，但多糖抗原多为非胸腺依赖性抗原，诱导体液免疫主要产生IgM免疫球蛋白，记忆反应微弱甚至缺失，同时，年龄幼小的动物常表现出年龄相关的多糖抗原无应答性。因此，后来的研究发现，荚膜多糖（或多糖）疫苗的免疫效果往往差强人意，其免疫效果比常规的全菌疫苗差。孙德君等人在“兔巴氏杆菌荚膜抗原疫苗与常规疫苗安全性和免疫效力的对比试验研究”[中国畜牧杂志，2011,47（12）：70-72]一文中公开了一种对兔巴氏杆菌株接种于0.1%裂解全血改良马丁肉汤中，然后采用物理方法进行粗提，制备荚膜疫苗的方法，并分别进行了荚膜疫苗和常规疫苗的安全性免疫效力及免疫期试验，免疫效力检验结果显示：荚膜疫苗的攻毒保护率为60%，较常规疫苗免疫效力偏低，但安全性好于常规疫苗。外膜蛋白作为多杀性巴氏杆菌另一种主要的保护性抗原，诸多学者对其免疫原性进行了大量的研究。上世纪，YUE-SHOUNGLU等先后证明了多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白在兔体能产生良好的免疫反应，并能对同源菌株的攻毒提供100%的保护。进入21世纪后，随着对巴氏杆菌外膜蛋白的成分、结构和功能研究的深入，研究者们对单个的外膜蛋白进行了免疫原性的研究，结果显示多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H（OmpH）、脂蛋白E（PlpE）和脂蛋白B（PlpB）等单一外膜蛋白具有良好的免疫原性，其中PlpB还具有不同血清型多杀性巴氏杆菌交叉保护的效果。多杀性巴氏杆菌外膜蛋白疫苗可以通过细菌培养物的直接提取进行实现，如LouisaB.Tabatabai等2004年对多杀性巴氏杆菌五种外膜蛋白的鉴定中所描述的一样，先后将菌体进行溶菌酶、EDTA、TritonX-100等进行处理，经过离心和萃取等环节获得外膜蛋白，这样得到的多为外膜蛋白混合物；多杀性巴氏杆菌外膜蛋白疫苗也可以通过特定外膜蛋白的基因克隆表达而实现，如JeongminLee等2007年在对OmpH免疫保护效果评价中所描述的那样，最后将工程菌体破碎后提取多杀性巴氏杆菌外膜蛋白的方法，这样获得的外膜蛋白为成分相对单一的外膜蛋白。两者均能获得免疫原性好的外膜蛋白，但操作步骤繁琐，难以实现规模化生产。因此，实有必要开发一种适合于工业化规模生产的，具备与常规全菌疫苗相同免疫效力，同时又安全无副作用的多杀性巴氏杆菌疫苗。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种多杀性巴氏杆菌无细胞抗原，该抗原制备方法简单，易于工业化规模生产，且具有良好的免疫原性；将本专利技术的无细胞抗原致敏绵羊红细胞后，可用于检测多杀性巴氏杆菌特异性抗体，该检测方法特异性和稳定性均较好。此外，将本专利技术的无细胞抗原添加佐剂和防腐剂后制备成疫苗，具有全菌疫苗同等的免疫效力，且不影响动物生长、疫苗注射部位局部副反应小的优点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供一种多杀性巴氏杆菌无细胞抗原，其中所述抗原来自灭活的多杀性巴氏杆菌培养物的上清液，所述上清液含有多糖和蛋白。所述多杀性巴氏杆菌培养物的上清液是通过将多杀性巴氏杆菌培养物离心或沉淀后取液体组分。在一具体实施方式中，所述多杀性巴氏杆菌培养物由液体培养基，在适宜温度，例如37℃下培养一定时间，例如12-16h后获得；也可以是由固体培养基培养后由无菌缓冲液或液体培养基洗下菌落（或菌苔）获得。在另一具体实施方式中，所述培养基中除了常规营养成分外，还含有一定量的血清。血清的浓度为2-20%（V/V），优选为5-15%（V/V），再优选8-10%（V/V），最优选为10%（V/V）。在一具体实施方式中，所述培养物的灭活所使用的灭活剂为甲醛溶液、或β-丙内酯，也可以通过物理方式进行灭活，如加热等。优选地，所述多杀性巴氏杆菌为本领域技术人员所熟知的强毒株，包括兔多杀性巴氏杆菌C51-2株、C57-17株和鸡多杀性巴氏杆菌C48-2株和1502株，也包括通过公用平台和临床病例分离鉴定获得的猪源性、兔源性及其它动物源性，例如牛或羊的多杀性巴氏杆菌强毒株。优选地，所述抗原中多糖含量为0.5-0.7mg/ml，所述抗原中蛋白含量为8.8-10.6mg/ml。优选地，所述多杀性巴氏杆菌无细胞抗原为动物多杀性巴氏杆菌无细胞抗原。所述动物为猪、兔、鸡、牛或羊。本专利技术的另一目的在于提供一种制备多杀性巴氏杆菌无细胞抗原的方法，该方法包括：将多杀性巴氏杆菌接种于含血清的培养基中，在30-40℃，优选为37℃下培养8-24h，得多杀性巴氏杆菌培养物，该多杀性巴氏杆菌培养物经灭活后离心或直接沉淀，弃菌体，取上清液即可获得同时含有多糖和蛋白的多杀性巴氏杆菌无细胞抗原。优选地，所述血清的浓度基于所述培养基为2-20%（V/V），优选为5-15%（V/V），再优选5-10%（V/V），最优选为10%（V/V）。优选地，所述培养基可以为脑心浸液肉汤、胰蛋白大豆培养基、马丁培养基、改良马丁培养基等商品化培养基，或含蛋白胨、酵母提取物、蛋白水解物等营养成分的配方培养基，在本专利技术的一具体实施例中，优选为改良马丁培养基。本专利技术的另一专利技术目的在于提供所述多杀性巴氏杆菌无细胞抗原在多杀性巴氏杆菌血清学检测中的应用。所述血清学检测包括间接血凝试验、琼脂扩散试验或ELISA等方法。在一具体实施方式中，本专利技术使用间接血凝试验方法，利用多杀性巴氏杆菌无细胞抗原检测血清中多杀性巴氏杆菌的特异性抗体。例如，采集新鲜抗凝绵羊血，洗涤后配制成红细胞悬液，然后用戊二醛醛化，再用鞣酸鞣酸化，得鞣酸化绵羊红细胞液。将该鞣酸化绵羊红细胞液与本专利技术所述多杀性巴氏杆菌无细胞抗原液混合，致敏，配成致敏红细胞悬液，可用于检测多杀性巴氏杆菌特异性抗体。本专利技术的目的还在于提供一种多杀性巴氏杆菌无细胞疫苗，其含有所述多杀性巴氏杆菌无细胞抗原、佐剂和防腐剂。优选地，所述多杀性巴氏杆菌无细胞抗原在疫苗中的终浓度为70本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多杀性巴氏杆菌无细胞抗原，其特征在于，所述抗原来自灭活的多杀性巴氏杆菌培养物的上清液，所述上清液含有多糖和蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种多杀性巴氏杆菌无细胞抗原，其特征在于，所述抗原来自灭活的多杀性巴氏杆菌培养物的上清液，所述上清液含有多糖和蛋白；其中，所述抗原中多糖含量为0.5-0.7mg/ml，所述抗原中蛋白含量为8.8-10.6mg/ml；所述抗原的制备方法包括：将多杀性巴氏杆菌接种于含血清的培养基中，在30-40℃下培养8-24h，得多杀性巴氏杆菌培养物，该多杀性巴氏杆菌培养物经灭活后离心或直接沉淀，弃菌体，取上清液即可获得同时含有多糖和蛋白的多杀性巴氏杆菌无细胞抗原。2.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌无细胞抗原，其特征在于，所述多杀性巴氏杆菌无细胞抗原为动物多杀性巴氏杆菌无细胞抗原。3.根据权利要求2所述的多杀性巴氏杆菌无细胞抗原，其特征在于，所述动物为猪、兔、鸡、牛或羊。4.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌无细胞抗原，其特征在于，所述血清的浓度基于所述培养基为2-20％(V/V)。5.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌无细胞抗原，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张许科，孙进忠，白朝勇，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41