获得分化的细胞和/或分化的细胞的产物的方法技术

本发明专利技术提供获得分化的细胞和/或分化的细胞的产物之任一方或两方的方法，其包括：向灌流的器官或活体组织导入未分化的细胞的工序，通过将导入的上述未分化的细胞与上述器官或活体组织一同灌流培养，使上述未分化的细胞分化而得到分化的细胞和/或分化的细胞的产物的工序，回收得到的含分化的细胞和/或分化的细胞的产物的灌流培养液的工序，及获得回收的上述灌流培养液中含的分化的细胞和/或分化的细胞的产物的工序。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】
本专利技术涉及从未分化细胞获得分化细胞或分化细胞的产物的方法。 【
技术介绍
】 使干细胞等的未分化细胞分化为希望得到的细胞的技术作为可应用于再生医疗 或各种各样的疾病的预防、治疗药的筛选等的技术而被期待。 以往、已知从干细胞在体外或体内得到分化细胞或其产物的方法。 在US 2010173414 Al中记载了，在如脱甲基化剂（5-氮杂胞苷及5-氮杂-2'脱 氧胞苷等）及组蛋白脱乙酰化酶抑制剂这样的使细胞的后成的状态发生变化的药剂的存 在下培养胚胎干细胞等，通过在各种生长因子或细胞因子的存在下培养来产生一次胚层的 方法。 在特开2004-135625号公报中记载了，将希望得到的组织及器官来源的细胞与成 体干细胞共培养作为特征的，诱导成体干细胞向体细胞分化的方法。在同一文献中公开的 方法中，为了共培养，有必要准备希望得到组织及器官来源的分化后的细胞。 在US 2012315338 Al中记载了，通过将血管芽细胞用含各种生长因子或细胞因子 的培养基培养而生成巨核细胞的方法、及培养生成的巨核细胞而产生血小板的方法。 在例如特开2002-171865号公报中记载了在体内得到分化细胞或其产物的方法。 在特开2002-171865号公报中记载，将人来源的内脏细胞或内脏干细胞经人以外 的动物的特定的导管投入，移植到人以外的动物的特定的部位而使增殖、分化之后，集合人 来源的内脏细胞的，人内脏细胞的制造方法。在同一文献中记载，可使移植的内脏细胞或内 脏干细胞某程度增殖之后，使用例如FACS(荧光活化细胞分检器）由表面抗原的差异分离 人细胞和动物细胞。 另外，在US 2009202977 Al中记载使用干细胞得到用于移植到患者的固体器官的 方法。在同一文献中记载了，通过将含表面活性剂的细胞破坏介质灌流到器官而制作脱细 胞化的器官，通过对于此脱细胞化的器官，在再生细胞在该脱细胞化的器官的内部或表面 植入、增殖和/或分化的条件下接触间质干细胞（MSC)等的再生细胞的集团而制作器官的 方法。 再者，在特开2012-19690号公报中记载评价干细胞是否可在活体内分化为构成 希望得到的组织的细胞的方法。在同一文献中记载的方法中，将成为评价对象的干细胞移 植到非人哺乳动物的希望得到的组织的原基中之后，在体外培养该组织原基，将移植的干 细胞来源的细胞的组织原基中的分散的程度作为指标，判断该干细胞可在活体内分化为构 成所述组织的细胞的可能性。 【
技术实现思路
】【专利技术要解决的技术课题】 但是，US 2010173414 Al或US 2012315338 Al中记载的方法中记载了，通过将干 细胞在含指定的物质的培养基中培养来得到分化细胞或其产物的方法，但有使培养细胞经 多次继代的必要等，培养条件烦琐。 另外，在特开2004-135625号公报中记载的方法中，为了使干细胞分化，有必要准 备用于共培养的分化的细胞。因此，当分化的细胞的获得或培养困难时，结果无法将干细胞 分化为目的细胞。 再者，在如特开2002-171865号公报中公开的在体内自干细胞得到分化细胞的方 法中，无法避免宿主细胞混入得到的分化细胞，其后的纯化工序成为负担。 然后，在US 2009202977 Al中，有通过将器官用含表面活性剂的细胞破坏介质进 行灌流而脱细胞化的必要，操作烦琐。 而且，特开2012-19690号公报中记载的方法由于以判断移植的干细胞是否适宜 于移植作为目的，不认为可回收分化细胞。 从而，本专利技术以提供操作简便、并且容易获得分化细胞的、从未分化细胞获得分化 细胞和/或分化细胞的产物的方法作为课题。 【解决课题的技术方案】 本专利技术提供获得分化的细胞及分化的细胞的产物之任一方或两方的方法，其包 括： 向灌流的器官或活体组织导入未分化的细胞的工序， 将导入的上述未分化的细胞与上述器官或活体组织一同灌流培养，使上述未分化 的细胞分化的工序， 回收含自上述未分化的细胞分化的细胞及上述分化的细胞的产物之任一方或两 方的灌流培养液的工序， 获得上述灌流培养液中含的分化的细胞及分化的细胞的产物之任一方或两方的 工序。 【专利技术效果】 由本专利技术可容易地获得分化细胞和/或其产物。 【【附图说明】】 【图1】是灌流培养系统的模式图。 【图2】是显示自MSC分化的细胞中的Runx2成骨细胞分化标志物的表达量的图。 纵轴是用β -肌动蛋白表达量补正的Runx2的相对表达量（单位无）。横轴表示回收的灌 流液级分的编号，"vitro MSC"表示体外培养细胞。 【图3】是使用回收的灌流培养液上清的血小板尺寸级分的FACS解析的结果。 【图4】是显示血小板自巨核细胞衍生K562细胞释放的样式的荧光显微镜照片。 【图5】是回收的血小板的透过型显微镜照片。 【图6】是显示回收后的灌流液中的血小板样体数和乳酸脱氢酶活性的关系的图。 【实施方式】 接下来参照附图描述本专利技术的优选的实施方式。 包括向灌流的器官或活体组织 导入未分化的细胞的工序。 其中，"导入"是指将未分化的细胞置于与器官或活体组织的内部或表面接触可能 的状态或使未分化的细胞接近器官或活体组织的内部或表面。例如可举出，未分化的细胞 和器官或活体组织置于互相接触的状态，未分化的细胞和器官或活体组织置于经相同的液 体存在的状态（即，使未分化的细胞和活体组织置于相同的液体中）等。更具体而言可举 出，向灌流液添加未分化的细胞之后，将该未分化的细胞送入器官或活体组织的内部，将含 未分化的细胞的液体经器官或活体组织的动脉或静脉注入或注射到该器官或活体组织的 内部，向浸渍器官或活体组织的液体添加未分化的细胞等。在本实施方式中，通过向灌流液 添加未分化的细胞，可向器官或活体组织导入未分化的细胞。 未分化的细胞被导入灌流的器官或活体组织。 灌流液的种类只要适宜于细胞的生命维持，就不特别限定，可举出例如培养基 (具体而言RPMI培养基（Roswell Park Memorial Institute培养基）、MEM培养基（最小必 需培养基）、DMEM培养基（Dulbecco氏改良的Eagle培养基）、Ham's F-12培养基等）、生理 盐水、器官保存液（UW液（University of Wisconsin溶液）、ET-京都液等）等。在灌流液 中也可含，例如细胞的生命维持等必要的添加物、例如红细胞、血浆、血清、氨基酸等。灌流 液的流速只要是导入的未分化的细胞自器官或活体组织释放的流速，就不特别限定。在器 官等的灌流中一般使用的流速可为、例如0.0 lmL/min以上100mL/min以下，优选为0.1 mL/ min以上20mL/min以下。灌流时的温度不特别限定。可为例如4°C以上40°C以下，优选为 20°C以上38°C以下，更优选为35°C以上37°C以下。灌流时间不特别限定。可为例如1分钟 以上3000分钟以下，优选为15分钟以上1500分钟以下，更优选为60分钟以上1000分钟 以下，更加优选为100分钟以上800分钟以下，再更加优选为200分钟以上600分钟以下。 再有，其中的灌流时间是指在未分化的细胞的导入前进行的灌流所耗的时间的总和。 再有，在导入未分化的细胞时，灌流也可停止。停止时间可优选为0. 1本文档来自技高网...

【技术保护点】
获得分化的细胞及分化的细胞的产物之任一方或两方的方法，其包括：向灌流的器官或活体组织导入未分化的细胞的工序，将导入的上述未分化的细胞与上述器官或活体组织一同灌流培养，使上述未分化的细胞分化的工序，回收含自上述未分化的细胞分化的细胞及上述分化的细胞的产物之任一方或两方的灌流培养液的工序，及获得上述灌流培养液中含的分化的细胞及分化的细胞的产物之任一方或两方的工序。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：小林英司，佐藤利幸，赤间健司，堀信康，柴山正树，相原祐希，门脇正和，
申请(专利权)人：希森美康株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP