miR‑2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能制造技术

miR‑2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能，属于细胞生物学技术领域，其特征在于：通过对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养，采用含2％马血清的分化培养基诱导牛骨骼肌卫星细胞分化，在诱导分化3天后，荧光显微镜下观察到MHC和Desmin在牛骨骼肌卫星细胞中的表达情况；采用茎环荧光定量RT‑PCR检测miR‑2400的表达量，采用EdU、PCNA免疫荧光、CCK‑8以及CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT‑PCR检测miR‑2400对骨骼肌卫星细胞增殖的影响；以上结果表明miR‑2400在调节牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程中具有一定的作用，能够显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖。

【技术实现步骤摘要】
miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能
本专利技术涉及miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能，属于细胞生物学

技术介绍
骨骼肌卫星细胞是肌组织的前体细胞、可塑性强，具有骨骼肌的许多重要生物特性，肌卫星细胞的激活、增殖和分化也是骨骼肌细胞肥大、数目增多以及肌纤维转化的重要机制.骨骼肌卫星细胞增殖分化过程十分复杂，涉及到大量基因的表达及网络调控。研究证实，miRNA在肌肉发育和肌细胞增殖与分化中发挥了关键性的调控作用(Luoetal.,2013)。因此研究miRNA在肌肉发育和肌细胞增殖与分化中分子机制可为肌肉损伤修复、肌肉再生等其他领域学科研究提供重要的理论基础，在改良家畜肌肉品质的畜牧业生产领域中具有广阔的应用前景。本研究对牛的骨骼肌卫星细胞进行分离，建立其体外培养的方法，并诱导分化使其成为肌细胞，对骨骼肌细胞中的标志性分子肌球蛋白重链和结蛋白进行免疫荧光染色，以证明分离的骨骼肌卫星细胞的性质和纯度。肌球蛋白重链(Myosinheavychain,MHC)是肌球蛋白的组成成分之一，是构成骨骼肌纤维内粗肌丝的主要成分，是骨骼肌纤维中表达最多的蛋白，是肌肉分化的指标之一。结蛋白(Desmin)是肌组织中重要的中等径骨架纤维蛋白，其在肌肉形态的形成与维持、细胞之间的信息传递、肌细胞分化调控等多方面具有非常重要的意义，由于专一性地出现在肌肉细胞及肌细胞来源的肿瘤细胞里,在平滑肌、骨骼肌和心肌细胞中表达，在维持肌细胞的完整性以及肌小节之间的信息传递中发挥作用(Lietal.,1993)。所以目前认为它可以作为肌肉分化的指标,用于发育生物学的研究。MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶[该酶是一种核糖核酸内切酶，属于RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(dsRNAs)，每个片段的3'端都有2个碱基突出。以上内容出自好搜百科http://baike.haosou.com/doc/5447817-5686185.html]加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。miRNA广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框(ORF)。成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基。编码miRNAs的基因最初产生一个长的pri-RNA分子，这种初期分子还必须被剪切成约70-90个碱基大小、具发夹结构单链RNA前体(pre-miRNA)并经过Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA5＇端的磷酸基团和3′端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA5＇端第一个碱基对U(尿苷)有强烈的倾向性，而对G(鸟苷)却排斥，但第二到第四个碱基缺乏U。一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C(胞苷)。这些分子能够与那些和它的序列互补的mRNA分子相结合，有时候甚至可以与特定的DNA片断结合。这种结合的结果就是导致基因的沉默。这种方式是身体调节基因表达的一个重要策略。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。miR-2400是存在于牛体内的miRNA，在miRBase数据库中的基本信息如图1(http://www.mirbase.org/cgi-bin/query.pl？terms＝miR-2400&submit＝Search)。miR-2400的茎环序列信息如图2。成熟miR-2400序列为：CCAGCACAGGCAGCUCGGACUGA，具体信息如图3，图中的参考文献：GlazovEA，KongsuwanK，AssavalapsakulW，HorwoodPF，MitterN，MahonyTJ.RepertoireofbovinemiRNAandmiRNA-likesmallregulatoryRNAsexpresseduponviralinfection.PLoSOne.2009，27，4(7):e6349.doi:10.1371/journal.pone.0006349。该文献发现了miR-2400，但没有对其生物学功能进行报道。如何研究miR-2400是否具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物学功能成为急需解决的一大难题？所以，专利技术miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能及其检测方法，验证miR-2400是否具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能是必要的。
技术实现思路
为了研究miR-2400是否具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能的难题，本专利技术提供了miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能，该miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能通过对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养，采用含2％马血清的分化培养基诱导牛骨骼肌卫星细胞分化，在诱导分化3天后，荧光显微镜下观察到MHC和Desmin在牛骨骼肌卫星细胞中的表达情况；牛骨骼肌卫星细胞分化后，MHC和Desmin在细胞具有阳性表达信号，从而证明本研究分离培养的为牛骨骼肌卫星细胞，且具有分化为肌管的能力；在牛的骨骼肌卫星细胞分化过程中，采用茎环荧光定量RT-PCR检测miR-2400的表达量，采用EdU(5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷)、PCNA(增殖细胞核抗原)免疫荧光、CCK-8(CellCountingKit-8，简称CCK-8)以及CCND2[G1/S-特异性周期蛋白-D2]和CDK6[周期蛋白依赖性激酶6]表达量的荧光定量RT-PCR检测miR-2400对骨骼肌卫星细胞增殖的影响；在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中，随着分化天数和分化程度的增加，miR-2400的表达量明显下降；EdU结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；PCNA免疫荧光结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；CCK-8检测结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT-PCR结果为miR-2400过表达后，与增殖相关的基因CCND2和CDK6表达量明显上升，转miR-2400抑制剂后与增殖相关的基因CCND2和CDK6表达量明显下降；以上所有结果均表明miR-2400在调节牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程中具有一定的作用，能够显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：miR-2本文档来自技高网...

【技术保护点】
miR‑2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能，其特征在于：通过对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养，采用含2％马血清的分化培养基诱导牛骨骼肌卫星细胞分化，在诱导分化3天后，荧光显微镜下观察到MHC和Desmin在牛骨骼肌卫星细胞中的表达情况；牛骨骼肌卫星细胞分化后，MHC和Desmin在细胞具有阳性表达信号，从而证明本研究分离培养的为牛骨骼肌卫星细胞，且具有分化为肌管的能力；在牛的骨骼肌卫星细胞分化过程中，采用茎环荧光定量RT‑PCR检测miR‑2400的表达量，采用EdU、PCNA免疫荧光、CCK‑8以及CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT‑PCR检测miR‑2400对骨骼肌卫星细胞增殖的影响；在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中，随着分化天数和分化程度的增加，miR‑2400的表达量明显下降；EdU结果为miR‑2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR‑2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；PCNA免疫荧光结果为miR‑2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR‑2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；CCK‑8检测结果为miR‑2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR‑2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT‑PCR结果为miR‑2400过表达后，与增殖相关的基因CCND2和CDK6表达量明显上升，转miR‑2400抑制剂后与增殖相关的基因CCND2和CDK6表达量明显下降；以上所有结果均表明miR‑2400在调节牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程中具有一定的作用，能够显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖。...

【技术特征摘要】
1.miR-2400用于促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖，其特征在于：通过对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养，采用含2％马血清的分化培养基诱导牛骨骼肌卫星细胞分化，在诱导分化3天后，荧光显微镜下观察到MHC和Desmin在牛骨骼肌卫星细胞中的表达情况；牛骨骼肌卫星细胞分化后，MHC和Desmin在细胞具有阳性表达信号，从而证明本研究分离培养的为牛骨骼肌卫星细胞，且具有分化为肌管的能力；在牛的骨骼肌卫星细胞分化过程中，采用茎环荧光定量RT-PCR检测miR-2400的表达量，采用EdU、PCNA免疫荧光、CCK-8以及CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT-PCR检测miR-2400对骨骼肌卫星细胞增殖的影响；在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中，随着分化天数和分化程度的增加，miR-2400的表达量明显下降；EdU结果为miR-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：严云勤，张伟伟，佟慧丽，李树峰，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23