用来自分化细胞的供体核克隆猪的方法技术

本发明专利技术提供包括将作为供体的分化的猪细胞的核移植入去核的卵母细胞的核转移的改进方法。获得的核转移单位通过产生胎儿和子代在增加基因型和转基因基因型方面是有用的。通过本方法有利于遗传工程或转基因猪的胚、胎儿和子代的产生，因为供体核的分化细胞来源能进行遗传修饰并能克隆繁殖。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
1.专利
本专利技术涉及将来自分化的猪细胞的细胞核移植入与供体核相同物种的去核的哺乳动物卵母细胞的克隆方法。核得到程序重排以指导克隆胚的发育，然后将克隆胚转移到雌性受体中产生胎儿和子代，或将其用于产生培养的内细胞团细胞(CICM)。克隆胚也可用于与受精胚结合产生嵌合胚、胎儿和/或子代。2.专利技术背景已有报道使用有蹄动物的内细胞群(ICM)细胞进行核移植。例如，Collas等在Mol.Reprod.Dev.38264-267(1994)中公开了通过将裂解的供体细胞显微注射入去核的成熟卵母细胞进行牛ICMs的核移植。Collas等公开了将胚在体外培养七天产生的十五个胚细胞转移入牛受体时使其中四头怀孕及两头生产。并且，Keefer等在Biol.Reprod.，50935-939(1994)中公开了在核转移方法中将牛的ICM细胞作为供体核产生的胚细胞移植入牛的受体时，产生了一些可存活的子代。并且，Sims等在美国国家科学院院报906143-6147(1993)中公开了通过将在体外短期培养的牛ICM细胞的核转移入去核的成熟卵母细胞可生产小牛。也有报道称转移培养的胎盘细胞的核后可产生能存活的小羊(Campbell等，自然，38064-68(1996))。更进一步地，核转移中牛多能胚细胞的使用和嵌合胎儿的产生已有报道(stice等，Biol.Reprod，54100-110(1996)；Collas等，Mol.Reprod.Dev.，38264-267(1994))。Collas等证明肉芽肿细胞(成体细胞)可用于牛克隆方法中以产生胚。但是，未能证明其发育可超过早期胚阶段(胚泡阶段)。并且，肉芽肿细胞不易培养并仅能从雌性获得。Collas等未尝试在培养中繁殖肉芽肿细胞或试图遗传修饰那些细胞。Wilmut等(自然，365810-813(1997))从胎儿成纤维细胞产生核转移绵羊子代，从成体绵羊细胞也产生一个子代。克隆猪细胞与其它物种的细胞相比更为困难。此现象可由下表进行说明 在产生转基因猪的领域中也存在问题。通过现有方法，将异源DNA引入在胎儿中分化成各种细胞类型并最终发育成转基因动物的早期胚或胚细胞系。但是，产生一个转基因动物需要许多早期胚，因此该方法是非常低效的。并且，没有在花费时间和经费将胚放入代理雌性体内之前筛选转基因胚的简单及有效的方法。此外，基因寻靶技术不易于用早期胚转基因技术完成。小鼠中的胚胎干细胞使研究人员能够筛选转基因细胞并进行基因寻靶。这导致与其它转基因技术相比将更多地使用遗传工程。但是，必需将胚胎干细胞系和其它胚细胞系维持在未分化状态，这需要饲养层和/或在培养基中添加细胞因子。即使采取了这些预防措施，这些细胞仍会经常发生自发分化并且不能通过现有可获得的方法产生转基因子代。并且，一些胚细胞系必须以不利于基因寻靶方法的方式进行繁殖。从早先预移植的小鼠胚中体外获得胚胎干(ES)细胞系的方法为大家所熟知。(见，例如Evans等，自然，29154-156(1981)；Martin，美国国家科学院院报，787634-7638(1981))。假如由于成纤维细胞的饲养层(Evans等，Id.)或分化抑制源(Smith等，生物学进展，1211-9(1987))存在的话，能使ES细胞以未分化状态传代。以前已报道ES细胞具有许多应用。例如，已报道ES细胞可用作分化的体外模型，特别可用于研究早期发育调节中涉及的基因。当将小鼠ES细胞引入预移植的小鼠胚时可产生种系嵌合体，从而证明了它们的多能性(Bradley等，自然，309255-256(1984))。由于ES细胞的可将其基因组传递到下一代的能力，它们具有通过使用带有或不带有所需的遗传修饰的ES细胞进行家畜动物种系操作的潜在用途。并且，在家畜动物如有蹄动物中，来自如预移植家畜胚的核可促进去核卵母细胞的发育(Smith等，Biol.Reprod.，401027-1035(1989)；和Keefer等，Biol.Reprod.，50935-939(1994))。相反，据报道来自小鼠超过8细胞阶段的胚的核在转移后并不促进去核卵母细胞的发育(Cheong等，Biol.Reprod.，48958(1993))。因此，来自家畜动物的ES细胞是非常所需的，因为它们可提供经遗传操作的全能性供体核的潜在来源或用于核转移方法。一些研究小组已报道了称为多能性胚细胞系的分离。例如，Notarianni等在J.Reprod.Fert.Suppl.，43255-260(1991)中报道了来自猪和绵羊胚泡的认为是稳定的全能性细胞系的建立，该细胞系表现出一些与从绵羊胚泡中免疫外科分离出的内细胞群的初级培养物的细胞相似的形态学和生长特性。同时，Notarianni等也在J.Reprod.Fert.Suppl.，4151-56(1990)中公开了来自猪胚泡的推定是全能性胚细胞系的培养物的维持和分化。Gerfen等在动物生物技术，6(1)1-14(1995)中公开了从猪胚泡中分离胚细胞系。这些细胞可在不使用条件培养基的小鼠胚的成纤维细胞饲养层中稳定维持，并且据报道在培养过程中分化成几种不同的细胞类型。并且，Saito等在Roux’s Arch.Dev.Biol.，201134-141(1992)中报道培养的牛胚胎干细胞样的细胞可存活三代，但在第四次传代后死亡。Handyside等在Roux’s Arch.Dev.Biol.，196185-190(1987)中公开了在分离来自小鼠ICMs的小鼠ES细胞系的条件下培养免疫外科分离的绵羊胚的内细胞群。Handyside等报道在这样的条件下，绵羊ICMs附着、扩散并发育出ES细胞样和内胚层细胞样细胞的区域，但在进行更长时间的培养后仅有内胚层样的细胞明显可见。近来，Cherny等在Theriogenology，41175(1994)中报道了来自称为多能性牛原生殖细胞的细胞系可在长期培养过程中维持。这些细胞，在培养约7天后，产生碱性磷酸酶(AP)染色为阳性的ES样的集落，表现出形成胚状体的能力，并自发分化成至少两种不同的细胞类型。据报道这些细胞还表达转录因子OCT4、OCT6和HES1的mRNA，这确信是专门由ES细胞表达的同源异型框基因的模式。并且，近来Campbell等在自然，38064-68(1996)中报道了将来自在促进小鼠中ES细胞系分离的条件下培养的9天龄绵羊胚的培养的胎盘(ED)细胞进行核转移之后，可产生存活的小羊。作者得出结论来自9天龄绵羊胚的ED细胞在经过核转移后是全能性的，并且这种全能性可在培养过程中得到维持。Van Stekelenburg-Hamers等在Mol.Reprod.Dev.，40444-454(1995)中报道了来自牛胚泡内细胞团细胞的称为永久细胞系的分离和特性描述。作者在不同的条件下分离并培养来自8或9天龄的牛胚泡的ICM以测定哪一种滋养细胞和培养基在促进牛ICM细胞的附着和生长中最为有效。他们得出结论培养的ICM细胞的附着和生长可通过使用STO(小鼠成纤维细胞)滋养细胞(代替牛的子宫内皮细胞)和使用补充以活性碳解吸的血清(而不是标准血清)的培养基得到增强。然而，Van Stekelenburg等报道了他们的细胞系更类似于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种克隆猪的方法，包括： （ｉ）在适于核转移（ＮＴ）单位形成的条件下，将所需的分化的猪细胞或细胞核插入去核的猪卵母细胞中； （ｉｉ）活化获得的核转移单位；及 （ｉｉｉ）将所说的培养的ＮＴ单位转移到宿主哺乳动物中从而使ＮＴ单位发育成胎儿。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：SL斯迪司，JM罗伯尔，J斯比里，P格路克，
申请(专利权)人：马萨诸塞大学，马萨诸塞州高等教育公立研究所，
类型：发明
国别省市：US[美国]